超快速液相色譜法同時測定梔子厚樸湯中京尼平苷和京尼平1-β-D龍膽雙糖苷的含量

史健藝，馮 波，曹慶賀，潘 旭，樸慧順，朱鶴云，關 皎

(1.吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013；2. 延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

梔子厚樸湯出自漢代張仲景所著的《傷寒論》，原文記載：“傷寒下后，心煩腹滿，臥起不安者，梔子厚樸湯主之”[1]。該方由梔子、厚樸和枳實共三味藥材組成，具有清熱除煩、寬中消滿等功效。研究表明，梔子厚樸湯中主要含有環烯醚萜苷類、木脂素類和黃酮類成分[2]，具有抗抑郁、抗焦慮、保肝利膽、抗失眠、增加冠狀動脈血流量、改善心肌代謝等多種生物活性[3-5]。目前，文獻報道的梔子厚樸湯質量控制主要采用高效液相色譜法[6-8]，存在專屬性差、分析時間長、樣品處理復雜等缺點。近年來，超快速液相色譜法(Ultra - fast liquid chromatography,UFLC)技術由于其在分離度、分離速度、靈敏度等方面均優于現在常規的HPLC方法，并可在較短的時間內達到柱平衡或重新平衡，顯著減少分析時間，同時相應會減少溶劑消耗，已越來越多的應用于中藥及中藥復方成分分析研究[9-11]。本試驗首次采用超快速液相色譜法同時測定梔子厚樸湯中的2種環烯醚萜苷類成分(京尼平苷和京尼平1-β-D 龍膽雙糖苷)的含量，所建立的定量分析方法分析時間短，分析效率明顯提高，可為梔子厚樸湯的質量評價提供科學依據，有利于將其藥用價值充分應用于獸藥行業，為天然藥物應用于獸藥領域提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；98-1-C型數字控溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)；TG16KR離心機(天津東旺儀器有限公司)；XK96-A型快速混勻器(新康醫藥器械有限公司)；AP-01P型真空泵(奧特賽恩斯儀器有限公司)；R-3HB型旋轉蒸發儀(瑞士歩琪公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；FW80型微型高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇(色譜純，美國Fisher科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher科技有限公司)；甲酸(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；京尼平苷對照品(批號：110749-201919，中國食品藥品檢定研究院)；京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷對照品(批號：16120502，成都普菲德生物技術有限公司)，純度均大于98%。

梔子、厚樸和枳實藥材，均購自吉林省吉林市吉林大藥房總店，產地分別為江西、四川以及湖南，經吉林醫藥學院生藥教研室雷鈞濤教授鑒定：梔子為茜草科植物梔子(GaradeniajasminoidesEllis.)的干燥成熟果實；厚樸(MagnoliaeofficinalisCortex.)為木蘭科植物厚樸(MagnoliaoffcinalisRend.et Wils.)的干燥干皮部、根皮部或枝皮部；枳實為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)的干燥幼果。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm,2.2 μm)，流動相為0.1% 甲酸水溶液(A)- 乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，7%B→12%B；5～11 min，12% B→13%B)，平衡時間為2 min，流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為240 nm，進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)和缺梔子陰性樣品(C)的UFLC色譜圖Fig.1 UFLC chromatograms of mixed reference substances (A),sample (B) and negative sample without Ganiema jasminoides Ellis (C)1: 京尼平1-β-D龍膽雙糖苷； 2: 京尼平苷1:Genipin 1-β-D-gentioglucoside; 2:Geniposide

2.2 對照品溶液的配制 取京尼平苷和京尼平1-β-D龍膽雙糖苷對照品適量，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，即得含京尼平苷1.0 mg/mL和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷1.0 mg/mL的單一成分對照品儲備液，置于4 ℃冰箱內保存備用。

2.3 供試品溶液的配制

2.3.1 全方供試品溶液的配制 依照梔子厚樸湯處方比例，分別稱取梔子9 g、厚樸12 g、枳實9 g，置于1 000 mL燒杯中，以料液比為1∶10室溫浸泡30 min， 控溫加熱煮沸后回流60 min，4層紗布過濾，濾渣加300 mL水同法提取，過濾，合并2次濾液，旋轉蒸發儀進行適當濃縮，轉移至50 mL容量瓶中定容后，轉移至培養皿中，-80 ℃樣品預凍24 h，可得梔子厚樸湯樣品干燥粉末，同法平行制作6份，依次編號為S1～S6，稱重并記錄，于干燥器中保存。計算全方出粉率為：S1(24%)、S2(24%)、S3(26%)、S4(23%)、S5(25%)、S6(26%)。

精密稱取全方凍干粉末樣品0.1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min后，再次稱重，用甲醇補足其失去的重量。13 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，舍棄初濾液，取續濾液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇定容至刻度，作為供試品溶液。

2.3.2 陰性對照供試品溶液的配制 依照處方量稱取除梔子以外的其他兩味組成藥材，按全方相同的制備方法處理，即得缺梔子的陰性對照供試品溶液。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下的京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷對照品儲備液適量，置于同一個5 mL量瓶中，用甲醇配制成京尼平苷質量濃度為10、20、50、100、200 μg/mL和500 μg/mL和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷質量濃度為1、2、5、10、20 μg/mL和50 μg/mL系列混合對照品溶液；充分混勻后，取混合對照品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，按“2.1”項下色譜條件依次進樣測定色譜峰面積，以對照品質量濃度X(μg/mL)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，結果京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的回歸方程分別為：

Y=3.568×104X-2.343×104，r=0.999 7
Y=1.601×104X-4.356×103，r=0.999 9

結果表明，京尼平苷與京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷分別在10～500 μg/mL、1～50 μg/mL的濃度范圍內與峰面積能夠呈現出良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.4”項下制備的京尼平苷質量濃度為100 μg/mL、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷質量濃度為10 μg/mL的混合對照品溶液 200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上。按上述色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷峰面積的RSD分別為0.7%和0.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，在室溫下分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12 h和24 h 進樣測定，記錄峰面積。結果京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷峰面積的RSD 分別為0.7%和0.8%，表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品6 份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，進樣測定，記錄峰面積，計算待測成分的含量。結果京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量平均值(n= 6)分別為5.54%和2.55%，RSD分別為0.7%和1.0%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量(京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量分別為5.54% 和2.55%)的梔子厚樸湯凍干粉樣品共9份，每份0.05 g，精密稱定，分別加入相當于樣品中京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份。按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL測定，計算京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的回收率和RSD，結果見表1。

表1 梔子厚樸湯中京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的回收率Table 1 Recoveries of geniposide and genipin-1-β-D-gentioglucoside in Zhizihoupu decoction

2.9 樣品含量測定 精密稱量6 批不同的梔子厚樸湯凍干粉樣品，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，進樣10 μL，每個供試品溶液進樣3 次，記錄峰面積，采用外標法計算京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量。6 批樣品測定結果見表2。

表2 梔子厚樸湯中京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量Table 2 The contents of geniposide and genipin-1-β-D-gentioglucoside in Zhizihoupu decoction

3 討論

3.1 流動相的優化 本試驗分別考察了甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水4種流動相體系。結果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水時作為流動相時，能夠獲得較好的分離效果，在該流動相條件下，分析時間僅為11 min，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定。

3.2 柱溫的選擇 本試驗分別考察了柱溫為30 ℃、 35 ℃和40 ℃時京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的分離情況，結果表明，柱溫為30 ℃時，以上2種物質能夠實現較好的分離。

3.3 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器(SPD-M20A)進行全波長掃描，得出京尼平苷與京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷分別在238 nm和240 nm 處有最大吸收。綜合考慮雜峰干擾，基線平穩，色譜峰響應等因素，本試驗選擇240 nm作為檢測波長。

3.4 提取時間及提取溶劑的選擇 本試驗分別對超聲提取時間20 min、30 min、40 min進行考察，綜合考慮優化提取效果并縮短提取時間，故選用30 min 為超聲提取時間。本試驗分別采用50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇進行超聲提取，結果顯示，100%甲醇的提取效率最高，出峰的效果好，試驗結果受雜峰的影響小，故選用純甲醇作為提取溶劑。

3.5 結語 本試驗建立超快速液相色譜法同時測定梔子厚樸湯中京尼平苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量，并應用該方法測定了6批凍干粉中上述2個活性成分的含量，方法穩定，重復性好，專屬性強，分析時間短，可為梔子厚樸湯質量控制和進一步體內研究提供參考。