商品肉雞梭菌性腸炎的試驗診斷

張 寒,孔垂民,劉宗柱,劉文華

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是動物腸道中的常在菌[1]，當受到應激因素影響或腸道微生物區系紊亂時，便會大量繁殖引起腸道鼓氣癥狀，并產生毒素作用于腸黏膜上皮細胞從而引起腸黏膜脫落，通常被認為是引起壞死性腸炎的主要病原菌[2-6]。隨著飼料中藥物添加劑的禁用，肉雞的壞死性腸炎愈加普遍，每年給全球家禽養殖業造成的損失超過了60億美元[7]。所以加強對該病的研究具有重要的經濟意義。本試驗對規模化肉雞養殖場送檢的臨床腸炎癥狀的肉雞腸道樣品進行了產氣莢膜梭菌的分離鑒定、藥敏試驗及同源性分析，為肉雞梭菌性腸炎的深入認識及預防控制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 山東部分地區肉雞養殖場送檢的臨床癥狀為腹瀉、拉肉樣便或過料的日齡不等肉雞的腸道樣品53份。

1.1.2 實驗動物 成年昆明系小鼠，購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.1.3 試劑 所用培養基、生化反應管，購自青島海博生物技術有限公司；PCR試劑，購自北京擎科生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.2 產氣莢膜梭菌的活菌計數 取回腸內容物1 g，用生理鹽水進行10倍倍比稀釋到106倍，取各稀釋度稀釋液按傾注平板法操作進行活菌計數[8]，42 ℃厭氧培養24 h，觀察結果，選擇菌落數在30～300的平板進行活菌計數。

1.2.3 細菌的生化試驗 牛乳爆烈發酵試驗：挑取純化菌落，接種于裝有含鐵牛乳培養基的試管中。42 ℃厭氧培養12 h，觀察結果。

微量發酵生化管鑒定：挑取純化好的菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖、棉子糖、蛋白胨和明膠生化管中，37 ℃厭氧培養12 h。

1.2.4 細菌毒素的多重PCR鑒定 挑取分離純化好的單菌落，利用煮沸法提取細菌的DNA作為模板，參照田冬青[9]針對產氣莢膜梭菌的α、β、ε、τ四種毒素基因的特異性引物進行多重PCR擴增，根據多重PCR擴增的電泳結果進行產氣莢膜梭菌的分型。

1.2.5 動物試驗 取患病肉雞腸道分離株單菌落接種FT培養基，厭氧培養8 h后，按1%比例接種皰肉培養基厭氧培養10 h后進行離心，分別取菌液離心上清液和皰肉培養基稀釋菌體沉淀調整濃度為109CFU/mL的菌液腹腔注射小鼠各5只，每只200 μL，同時設注射等體積的皰肉培養基作為攻毒對照組。每組隔離飼養觀察72 h，記錄小鼠發病和死亡情況。

1.2.6 產氣莢膜梭菌的藥敏試驗 選取分離的43株雞源產氣莢膜梭菌利用紙片擴散法進行藥敏試驗。選取苯唑西林、青霉素G、紅霉素、大觀霉素、萬古霉素、克林霉素、四環素、米諾環素、諾氟沙星、環丙沙星、左氟沙星、新霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、卡那霉素15種藥物進行藥敏試驗，根據《歐盟藥敏試驗標準》進行判定。

1.2.7 產氣莢膜梭菌的16S rRNA基因序列擴增及進化樹分析 選取13株自不同宿主和不同地區分離的產氣莢膜梭菌與1株A型產氣莢膜梭菌標準株利用16S rRNA基因的通用引物27 F和1492 R進行PCR擴增[10]。將與預期片段大小一致的PCR擴增產物送往上海派森諾生物股份有限公司進行測序。測序結果與NCBI核酸數據庫進行Blast比對。對14株不同來源的產氣莢膜梭菌的16S rRNA基因序列利用MEGA7.0進行遺傳進化關系分析。

2 結果

2.1 菌落及菌體形態的觀察 菌株在TSC培養基厭氧培養24 h后，菌落中間呈黑色，周圍出現乳白色渾濁圈(見中插彩版圖1A)。在綿羊血平板上形成灰白色、邊緣整齊的大菌落，并產生雙重溶血(見中插彩版圖1B)。顯微鏡油鏡下可見革蘭陽性的兩端鈍圓的粗大桿菌(見中插彩版圖1C)。

圖1 菌落及菌體形態觀察結果Fig.1 Results of colony and bacteria morphologyA:細菌在TSC平板的菌落形態； B:細菌在血平板的菌落形態； C:細菌鏡檢結果 (1 000×)A:Morphology of bacterial colony on TSC; B:Morphology of bacterial colony on blood plate; C:Microscopic results of bacterial staining (1 000×)

2.2 菌落計數結果 傾注平板法顯示所檢測的腸道內容物活菌數量均在106CFU/g以上，而健康雞腸道內容物的活菌數量為102～103CFU/g。

2.3 細菌的生化鑒定 牛乳爆烈發酵試驗結果表明：細菌在含鐵牛乳培養基中培養12 h后，由于發酵牛乳中的乳糖并產生大量氣體使牛乳凝固成海綿狀(圖2)。

圖2 牛乳爆烈發酵試驗Fig.2 Milk burst fermentation test1～4: 接種臨床分離株； 5: 接種標準株； 6: 陰性對照1～4: Inoculation of clinical isolates;5: Inoculation of standard strains; 6: Negative control

生化試驗結果如表1所示，根據《伯杰細菌鑒定手冊》的鑒定標準，初步判定分離菌株為產氣莢膜梭菌。

表1 分離株及標準株的生化特性鑒定統計Table 1 Statistical table for identification of biochemical characteristics of isolates and standard strains

2.4 細菌毒素的多重PCR檢測 針對產氣莢膜梭菌的α、β、ε、τ四種毒素基因對分離到的43株產氣莢膜梭菌進行多重PCR鑒定分型的PCR凝膠電泳結果如圖3所示，所有分離株均擴增出202 bp的單一條帶，與A型產氣莢膜梭菌毒素基因的擴增條帶吻合，說明分離的菌株全部為A型產氣莢膜梭菌。

圖3 產氣莢膜梭菌4種毒力基因的多重PCR鑒定Fig.3 Detection of 4 toxin genes of Clostridium perfringens by multiplex PCRM： DL-2 000； 1～11： 臨床分離株； 12： A型標準株； 13： 陰性對照M： DL-2 000; 1～11： Clinical isolates;12： Standard strain of type A; 13： Negative control

2.5 動物試驗結果 攻毒產氣莢膜梭菌上清液組小鼠在14 h內全部死亡，而只攻毒細菌組與皰肉培養基對照組在整個觀察期內未出現小鼠發病和死亡。對死亡小鼠進行剖檢發現腸道出血現象明顯，而攻毒細菌組和皰肉培養基對照組小鼠剖檢腸道均正常。

2.6 不同來源產氣莢膜梭菌的耐藥性分析 藥敏試驗結果如圖4所示，43株不同來源的菌株對紅霉素、新霉素、卡那霉素有很高的耐藥性，耐藥率在80%以上，而對萬古霉素、米諾環素、氨芐西林、頭孢噻肟的耐藥性相對較低。

圖4 產氣莢膜梭菌的藥敏試驗Fig.4 Results of susceptibility test of Clostridium perfringens

2.7 不同來源產氣莢膜梭菌的16S rRNA進化樹分析 選取前期不同宿主或不同地區分離的13株產氣莢膜梭菌與1株A型產氣莢膜梭菌標準株，利用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，獲得了預期約1 400 bp 的目的條帶(圖略)。將測序獲得的16S rRNA 基因序列在GenBank進行Blast比對，結果表明，擴增的細菌均為產氣莢膜梭菌，測序序列利用MEGA 7進行遺傳進化分析(圖5)。由系統進化樹可知，臨床分離的來自不同地區和不同宿主的A型產氣莢膜梭菌基于16S rRNA基因序列水平上的進化關系沒有明顯規律，不同宿主來源的菌株反而比相同宿主來源的菌株親緣關系更近。

圖5 不同來源的產氣莢膜梭菌16S rRNA序列進化樹Fig.5 Phylogenetic tree by 16S rRNA of Clostridium perfringens from different sources

3 討論

產氣莢膜梭菌主要通過在腸道定殖后分泌毒素對腸黏膜造成損傷，引起壞死性腸炎的典型癥狀[11]。由于正常動物腸道中也可以分離到該菌，一般認為引起壞死性腸炎癥狀的數量需達到106CFU/g以上[8]，所以對臨床可疑病例應進行該菌的活菌計數。本試驗選擇了傾注平板法進行活菌計數，相較其他菌落計數方法，結果更為可靠。在細菌分離過程中，不能單純根據在TSC培養基上呈現周圍有白色渾濁圈的黑色菌落特征作為判定產氣莢膜梭菌的唯一依據，實驗室曾分離到在TSC平板上具有該菌典型菌落特征但不能分解棉子糖和不產生爆烈發酵現象的菌株，經鑒定，該菌為爪狀芽孢梭菌，所以需要結合生化試驗和測序進行綜合判斷。對于產氣莢膜梭菌的分型，Kokeala H A等[12]通過毒素中和試驗與多重PCR比較發現2種方法的結果一致，相比較而言，多重PCR更省時省力且快速，所以多重PCR技術在臨床應用中比毒素中和試驗具有更大的優勢。本試驗分別通過注射細菌和上清液的方式對小鼠進行了攻毒，發現上清液是導致動物死亡的主要因素，進一步說明產氣莢膜梭菌的毒素是主要致病因子。

本試驗選取了臨床常用的7類抗生素中的15種，通過紙片法藥敏試驗對不同宿主來源的產氣莢膜梭菌進行的耐藥性分析結果表明，分離菌株對選擇的15種抗生素具有不同程度的耐藥性。治療產氣莢膜梭菌引起的腸炎，青霉素是臨床上常用藥物，但極易產生耐藥性，本試驗分離到的菌株對青霉素的耐藥率達到了23%，萬古霉素作為一種超級抗生素，本試驗分離到菌株對其全部敏感，并未發現超級耐藥菌的出現。該藥敏試驗結果可對臨床防治梭菌性腸炎提供一定的參考依據。系統進化樹是檢測物種進化關系的常用方法，本試驗對不同地區和不同宿主來源的14株A型產氣莢膜梭菌進行了16S rRNA基因系統進化樹的構建，發現不同來源的菌株在分布地區、宿主來源沒有明顯的規律，即A型菌株即使來源不同，但同源性差異不大，說明該菌不具有宿主特異性，可能與來源于環境有關。另外，16S rRNA基因序列保守性較強，用于同源性較近的菌株分類具有一定局限性。