HN蛋白糖基化位點(diǎn)缺失的新城疫病毒的生物學(xué)特性研究

艾 惠，孫軍峰，陳琳娜，李 樂，韓宗璽，劉勝旺

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)感染禽類引起的一種急性、高度接觸性傳染病，呈世界性分布，嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)，能夠造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。NDV遺傳進(jìn)化的變化是一個逐步積累的過程，點(diǎn)突變是NDV變異的主要方式。病毒的不斷演化和變異是使NDV的毒力等生物學(xué)特性發(fā)生變化的一個重要的原因。血凝素-神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白是一種II型囊膜蛋白，是NDV的重要免疫原性蛋白和毒力影響因素。研究表明，HN蛋白中和表位(346～353)中的347位氨基酸殘基存在E-K的變異，并且含有這種變異的毒株抗原性與傳統(tǒng)毒株存在抗原性差異[2]。

N-鏈接的糖基化修飾作為一種最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，病毒囊膜糖蛋白能夠利用細(xì)胞的這一功能進(jìn)行修飾，并最終影響病毒蛋白的穩(wěn)定性、抗原性和生物學(xué)功能[3-4]。NDV的HN蛋白含有6個潛在的N-鏈接的糖基化修飾位點(diǎn)(119、341、433、481、508位和538位殘基)，分別命名為G1、G2、G3、G4，G5和G6，其中前4個確實(shí)發(fā)生N-鏈接的糖基化修飾。據(jù)報道，HN蛋白跨膜區(qū)突變和N-糖基化缺失影響病毒的吸附、神經(jīng)氨酸酶活性和融合促進(jìn)活性[5]。通過反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救獲得了HN蛋白糖基化位點(diǎn)缺失的突變病毒，進(jìn)一步研究表明，HN蛋白糖基化缺失能夠致使毒力降低[6]。

本研究分離到了1株NDV ck/CH/LHLJ170302，遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其屬于class II類中的基因II型，與LaSota疫苗株親緣關(guān)系較近。基因分子特征分析發(fā)現(xiàn)，ck/CH/LHLJ170302株HN蛋白中缺失了433位(G3)的糖基化修飾位點(diǎn)，為探究糖基化位點(diǎn)缺失對ck/CH/LHLJ170302生物學(xué)特性的影響，本研究比較分析了ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株在生長特性、致病性和抗原性方面的差異，為NDV的遺傳變異提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動物 LaSota疫苗株；黑龍江某養(yǎng)雞場中采集咽拭子樣品，分離出1株NDV毒株，命名為ck/CH/LHLJ170302。DF-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；9～11日齡的SPF雞胚、SPF雞及雞紅細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑 體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒，購自Axygen公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、Gel Extraction Kit膠回收純化試劑盒，均購自美國OMEGA公司；pMD18-T載體、ExTaq?DNA Polymerase，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 病毒的純化 根據(jù)文獻(xiàn)[7]中的方法步驟，用雞胚有限稀釋法純化病毒，純化的病毒-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒RNA的提取、基因組的擴(kuò)增及測序 利用體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒提取純化的ck/CH/LHLJ170302株病毒基因組RNA。利用文獻(xiàn)[7]中報道的NDV class II全基因組測序引物序列，用一步法RT-PCR試劑盒擴(kuò)增ck/CH/LHLJ170302株基因組各片段。回收擴(kuò)增后的片段并克隆至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后挑取單個克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定。同一片段挑取多個陽性克隆，由哈爾濱睿博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，取3個以上的相同測序結(jié)果作為每個目的片段的序列結(jié)果。

1.5 病毒基因分子特征分析 以LaSota疫苗株為參考，根據(jù)測序結(jié)果拼接獲得ck/CH/LHLJ170302株的全基因組序列，比較ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株之間各基因的核苷酸、編碼的氨基酸的相似性以及F蛋白和HN蛋白的N-鏈接糖基化位點(diǎn)、半胱氨酸殘基及中和表位氨基酸的差異。

1.6 病毒的遺傳進(jìn)化分析 從GenBank中下載19株NDV代表性毒株的F基因編碼序列作為參考序列，構(gòu)建F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 病毒的生長動力學(xué)特性及致病指數(shù)測定 根據(jù)文獻(xiàn)[7]中的方法，測定ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株的雞胚半數(shù)感染量(EID50)，以100 EID50的劑量接種9日齡SPF雞胚，不同時間點(diǎn)收取尿囊液測定病毒滴度，用GraphPad Prism 5軟件繪制生長動力學(xué)曲線。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)致病指數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)，測定LaSota株與ck/CH/LHLJ170302 株的雞胚死亡平均時間(Mean death time，MDT)和1日齡SPF雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(Intracerebral pathogenicity index，ICPI)。

1.8 病毒抗血清的制備 將4周齡的SPF雞隨機(jī)分為2組并飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中，每組5只；將LaSota株和ck/CH/LHLJ170302株按106EID50的量通過點(diǎn)眼和滴鼻的方式分別進(jìn)行免疫接種，0.2 mL/只。首次免疫2周后，以同樣劑量通過靜脈注射途徑加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫14 d后，撲殺采血，分離血清，將血清置于56 ℃滅活30 min，分裝后，于-70 ℃ 保存待用。

1.9 病毒抗原相關(guān)性分析 用純化的病毒和制備的血清在DF-1細(xì)胞中進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)以研究ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株的抗原性差異，按Archetti方法計(jì)算抗原差異系數(shù)R[8]。判斷標(biāo)準(zhǔn)：R<0.5，表明病毒之間的抗原有較大差異；0.5≤R≤0.67，表明病毒之間的抗原差異較小；0.67≤R≤1.5，表明病毒之間抗原沒有差異。

2 結(jié)果

2.1 遺傳進(jìn)化及病毒基因序列分析 測序拼接結(jié)果顯示，ck/CH/LHLJ170302株基因組全長為15 186nt。基因組結(jié)構(gòu)特征與class II類NDV毒株一致。F基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，ck/CH/LHLJ170302株屬于class II類基因II型病毒，且ck/CH/LHLJ170302 與class II中基因II型LaSota疫苗株親緣關(guān)系最近(圖1)，進(jìn)一步比較分析了ck/CH/LHLJ170302株與基因II型LaSota疫苗株各基因編碼區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，結(jié)果顯示，ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株的各基因之間均具有較高的核苷酸和氨基酸一致性(表1)。

圖1 Class II 類 NDV 的 F 基因遺傳進(jìn)化分析Fig.1 The phylogenetic tree of class II NDV strains based on the F gene

2.2F基因序列分析 ck/CH/LHLJ170302株F基因開放閱讀框(ORF)長度為1 662 bp，編碼553個氨基酸，包含13個半胱氨酸和6個潛在的糖基化位點(diǎn)，均與LaSota株一致。ck/CH/LHLJ170302株F蛋白裂解位點(diǎn)處氨基酸為112G-R-Q-G-R-L117，具有NDV弱毒株的典型特征(表2)。F蛋白中和抗原表位分析發(fā)現(xiàn)，ck/CH/LHLJ170302株中和抗原表位的氨基酸與LaSota株中和抗原表位的氨基酸一致。另外，與LaSota株相比，二者F蛋白氨基酸的同源性為99.6%(表1)。上述結(jié)果表明，ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株的F基因分子特征無明顯差異。

表1 ck/CH/LHLJ170302與LaSota各基因編碼區(qū)相似性比較Table 1 Comparison of similarity between coding regions of each gene of ck/CH/LHLJ170302 and LaSota (%)

表2 ck/CH/LHLJ170302病毒株與LaSota疫苗株的生物學(xué)特性比較Table 2 Comparison of biological characteristics of ck/CH/LHLJ170302 virus strain and LaSota vaccine strain

2.3HN基因序列分析 ck/CH/LHLJ170302株HN基因ORF全長為1 734 bp，編碼577個氨基酸，含有12個半胱氨酸殘基，與LaSota株一致。但ck/CH/LHLJ170302株的HN基因僅含有5個潛在的糖基化修飾位點(diǎn)，與LaSota株相比，缺失了433位(G3)的糖基化修飾位點(diǎn)。另外，ck/CH/LHLJ170302株HN蛋白中抗原位點(diǎn)的氨基酸序列與LaSota的氨基酸序列沒有差異。

2.4 病毒的滴度及致病指數(shù)測定 ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株的病毒滴度測定結(jié)果表明，二者的血凝(HA)滴度和EID50之間沒有顯著差異。毒力指標(biāo)測定結(jié)果(MDT和ICPI)表明，ck/CH/LHLJ170302株符合NDV弱毒株的標(biāo)準(zhǔn)，與LaSota相比，ck/CH/LHLJ170302和ICPI值有所降低，但ck/CH/LHLJ170302的MDT則提前了近20 h(表2)。

2.5 病毒的生長動力學(xué) 將ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株接種SPF雞胚，測定病毒的生長動力學(xué)曲線。結(jié)果表明，2株病毒均在接種雞胚96 h后達(dá)到最高生長滴度，但ck/CH/LHLJ170302株在24 h、48 h和72 h病毒滴度均顯著高于LaSota株(P<0.05)(圖2)。

圖2 ck/CH/LHLJ170302病毒株與LaSota疫苗株在SPF雞胚中的生長動力學(xué)曲線Fig.2 Growth kinetics curve of ck/CH/LHLJ170302 strain and LaSota vaccine strain in SPF chicken embryo注: 與LaSota組比較，*：P<0.05Note: Compare with LaSota,*：P<0.05

2.6 抗原相關(guān)性分析 制備ck/CH/LHLJ170302株和LaSota株的血清后，在DF-1細(xì)胞中進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)以評價二者的抗原相關(guān)性。結(jié)果顯示，ck/CH/LHLJ170302與LaSota的抗原差異系數(shù)值R為1，表明ck/CH/LHLJ170302與LaSota沒有明顯的抗原差異。

3 討論

NDV在家禽中持續(xù)存在和流行以及由于點(diǎn)突變的積累而產(chǎn)生的變異病毒持續(xù)威脅著家禽養(yǎng)殖業(yè)，近年來，由于HN抗原位點(diǎn)變異而產(chǎn)生的NDV抗原變異毒株逐漸增多。此外，NDV HN蛋白中N-鏈接的糖基化位點(diǎn)對于維持HN蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和抗原性具有重要作用[9]。

在先前的研究中，相關(guān)研究者利用反向遺傳系統(tǒng)獲得了缺失HN蛋白4個糖基化位點(diǎn)(G1、G2、G3和G4)以及同時缺失G1和G2兩個糖基化位點(diǎn)的突變病毒，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，所有糖基化位點(diǎn)缺失的突變病毒的IVPI值與ICPI值均低于親本病毒，說明糖基化位點(diǎn)缺失致使毒力降低，尤其G4的缺失和G1、G2的聯(lián)合缺失能夠顯著降低NDV的致病性。并且，上述突變病毒與親本病毒的生長曲線結(jié)果表明，突變病毒(rG1、rG2和rG3)在感染后32 h和40 h的滴度明顯高于親本病毒[6]。本研究對ck/CH/LHLJ170302株進(jìn)行了F基因遺傳進(jìn)化分析與各基因分子特征分析，結(jié)果表明，ck/CH/LHLJ170302株屬于class Ⅱ類基因Ⅱ型，與LaSota疫苗株的親緣關(guān)系較近，并且發(fā)現(xiàn)ck/CH/LHLJ170302株的HN蛋白中天然缺失了433位的糖基化修飾位點(diǎn)(G3)。通過病毒的MDT和ICPI這兩項(xiàng)致病指數(shù)衡量了ck/CH/LHLJ170302株的毒力，結(jié)果表明，ck/CH/LHLJ170302株的MDT為79.2 h，相較于LaSota株的MDT，提前了大約20 h。ck/CH/LHLJ170302株的ICPI為0.175，較LaSota株的ICPI值略微有所降低，上述結(jié)果可以表明，ck/CH/LHLJ170302為緩發(fā)型弱毒株。另外，生長動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ck/CH/LHLJ170302株的生長速度要高于LaSota株。ck/CH/LHLJ170302株與LaSota株在毒力和生長特性上的差異是否是由于ck/CH/LHLJ170302株HN蛋白中糖基化修飾位點(diǎn)的缺失造成的需要進(jìn)一步探究。此外，鑒于ck/CH/LHLJ170302株的生長速度高于LaSota株，推測ck/CH/LHLJ170302株可能是LaSota株在雞群中長期存在并適應(yīng)形成的突變毒株，這需要進(jìn)一步的證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)了HN蛋白糖基化位點(diǎn)天然缺失的NDV，并且其生物學(xué)特性發(fā)生了一定程度的變化，表明需要加強(qiáng)對NDV的流行病學(xué)監(jiān)測和研究，為我國NDV的遺傳變異防控提供參考數(shù)據(jù)。