肉牛病毒性腹瀉/黏膜病繼發產氣莢膜梭菌感染的診斷與處置

黨如意，畢友坤,王 斌，葉 超，張 娜，楊增岐

(西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

2018年5月份西北部甘肅省某肉牛場發生疫情，短時間內有20余頭牛發病，其中有11頭發生猝死。病發前1個多月，該肉牛場先后從甲、乙兩地購回2批共20余頭7～10月齡的小牛，2批牛間隔半月時間。2018年5月初，先是從乙地購回的牛發病，后波及甲地牛和本場牛，前后不到1個月時間，牛陸續發病達27頭，死亡11頭，病死率達40%以上。結合臨床癥狀和剖檢結果，懷疑為牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染，為確診疫情，結合臨床癥狀和實驗室診斷等，最終確診為牛病毒性腹瀉/黏膜病繼發產氣莢膜梭菌感染。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品和實驗動物 無菌采集該養殖場病死牛的心臟、脾臟、肺臟、腸組織以及腸道黏膜刮取物各2份(編號分別為1和2)，其中1份用于總RNA提取，-80 ℃保存；1份用于細菌分離培養鑒定；昆白系小鼠,購自中國人民解放軍空軍軍醫大學；W0841 BVDV陽性毒株,購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑，購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa公司)；RT-PCR反轉試劑盒以及PCR Mix，購自GenStar康潤生物公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.3 引物 利用Primer5.0軟件設計BVDV鑒定引物，預計擴增產物長度為218 bp，設計好的引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

1.4 方法

1.4.1 牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測 用無菌的剪刀和鑷子分別采取送檢材料肺臟和腸道黏膜刮取物各2.0 g于組織研磨器中，充分研磨后，加入10 mL PBS混勻，以3 000 r/min離心5 min后，取1.0 mL上清液于1.5 mL無菌管中，2份樣品分別編號為1和2，備用。TRIzol法提取病毒總RNA，使用GenStar反轉試劑盒進行反轉錄，以產物為模板進行PCR擴增。

1.4.2 細菌學診斷 無菌操作取病死牛心、肝、肺及腸等病料，分別接種血平板，37 ℃進行有氧和厭氧培養 24 h。離心管收集病牛腸及內容物，于80 ℃水 浴10 min，離心，取上清液接入肉肝湯中，37 ℃ 厭氧培養24 h。培養物進行革蘭染色。取肉肝湯培養物繼續接種血平板，厭氧培養36 h。

1.4.3 動物接種試驗 取100 μL上述培養物腹腔注射3只昆白系小鼠，以生理鹽水作為對照。觀察小鼠狀態，如有死亡對其進行剖檢。

1.4.4 藥物敏感性試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法對分離菌進行18種抗生素的藥敏試驗。

2 結果

2.1 臨床診斷 病牛體溫升高，精神沉郁，口鼻、唇齒等黏膜充血、出血、潰瘍，流涎，出現腹瀉，糞便呈水樣、惡臭。重癥牛結膜發紺，瀕死期很短，僅3～5 min，蹬腿掙扎。

2.2 PCR檢測 PCR擴增結果如圖1，片段大小為218 bp，測序結果序列和NCBI中登錄的BVDV序列比對，二者同源性為100%。

圖1 PCR擴增結果M：DL-2 000 DNA Marker;1：陽性對照;2：陰性對照;3、4：病料樣品

2.3 細菌學診斷 厭氧培養18 h后，肉肝湯呈現渾濁狀，有氣泡。培養物進行革蘭染色發現散在或成對的革蘭陽性大桿菌。培養物接種血平板，厭氧培養36 h，血平板上長出1～3 mm大小、表面光滑并呈半透明狀的圓屋頂樣菌落，周圍有溶血環。25 ℃放置1 h左右，溶血環外圍的紅細胞變為淺綠色。革蘭染色鏡檢為散在或成對的革蘭陽性大桿菌，兩端略微鈍圓，基本無鏈狀排列。將其純化接到牛乳中厭氧培養6 h后，牛乳爆裂。取血平板上的菌落進行α毒素檢測，利用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，將產物進行測序分析，確定為產氣莢膜梭菌。

2.4 小鼠接種試驗 腹腔接種 4 h后小鼠死亡。對死亡小鼠進行剖檢發現心、肺病變不明顯，肝臟充血、色暗紅、易碎，脾臟充血，腎臟充血、質地軟，胃壁變薄、內有氣體，腸充氣、壁薄有出血，十二指腸變紅色。將小鼠肝、腸、脾、腎進行染色鏡檢，均可見散在或成對的革蘭陽性大桿菌，兩端略微鈍圓。

2.5 藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)標準進行判定，藥敏試驗結果如表1。

表1 分離菌藥敏試驗結果

3 討論

牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVD-MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起牛、羊和豬等動物的一種接觸傳染性疾病[1]。BVD-MD發生后，牛抵抗力下降，腸道菌群紊亂，極易誘發外源或條件性致病原感染，加劇病情和死亡。產氣莢膜梭菌，屬典型的條件致病菌，革蘭染色陽性，菌體兩端鈍圓，能形成芽孢[2]。當牛從污染的環境中攝取其菌體或芽孢，或由其他因素導致牛的胃腸道內環境破壞、腸道菌群失調、免疫力下降時，菌體便可侵襲繁殖并產生大量毒素，使牛發病。

鑒于牛病毒性腹瀉繼發產氣莢膜梭菌在牛場的發病率和致死率都很高，對該病的防治提出建議，為類似病例診斷和治療提供參考。首先對有臨床表現的牛進行隔離，以對癥治療、解毒保肝為原則，結合藥敏試驗結果，對發病牛給以抗病毒及抗梭菌類藥物，如病毒唑、黃芪多糖、環丙沙星或慶大霉素，輔以中成藥解毒劑、肝泰樂等。病情嚴重者，配合葡萄糖溶液靜脈注射，并適量給予碳酸氫鈉、維生素C和維生素K3等[3-4]。徹底清理廄舍內所有病牛排泄物以及被污染的墊料、食槽、用具等，并進行消毒，圈舍外及舍內過道全部撒以生石灰或漂白粉。暫停青貯飼料喂牛，對隔離牛給以優質青粗飼料。選用質量可靠的牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活苗、弱毒苗[5]，以減少發病造成的損失。

發病牛場采取上述處理措施后，再未出現新的病例。而且被隔離的病牛經治療全部恢復。牛病毒性腹瀉/黏膜病在該省牛群中普遍存在，隱性感染情況嚴重[6]。該牛場此次發病，源于其外購牛回場前未做檢疫，并直接與本場其他牛進行混群飼養，從而導致病毒性腹瀉/黏膜病的發生和傳播。發病牛因消化道受損，導致消化機能紊亂、腸道微生物菌群平衡失調、免疫力和抵抗力下降，產氣莢膜梭菌伺機感染并產生毒素，兩病合力，加之處置不及時，從而造成部分牛死亡的嚴重損失。此事件進一步提醒廣大養殖者，引種或者外購動物，必須加強隔離檢疫，防止牛源生物制品的BVDV污染[7]，以免造成不必要的損失。以養牛業為主的地區，可根據養殖情況、牛病毒性腹瀉/黏膜病血清抗體監測情況等，制定切實可行的控制或根除計劃，以達到本病的地區凈化。