豬丹毒活疫苗活菌計數參考品的研究

劉 博，張 媛，袁 璐，曾 雪，李春雪，楊麗萍，王秀麗，辛凌翔，李 建，羅玉峰

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀 100081；2.遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000；3.哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江 哈爾濱 150069)

豬丹毒是由豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae,E.rhusiopathiae)引起豬的一種急性、熱性傳染病[1]。急性型豬丹毒具有病程短、死亡率高等特點，再加上抗生素藥物使用的局限性，采用疫苗免疫接種是防控豬丹毒的首選[2-3]。

二〇一五版《中國獸藥典》中收錄的豬丹毒活疫苗有豬丹毒活疫苗GC42株、豬丹毒活疫苗G4T10株以及豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯活疫苗[4]。活菌計數是豬丹毒類活疫苗質量標準一個重要的檢驗參數。本試驗制備并標定了一批豬丹毒活疫苗活菌計數參考品[5]，以期可以對豬丹毒類活疫苗活菌計數進行質控，以保證疫苗活菌計數檢驗結果的客觀公正，提高檢驗工作效率。

1 材料與方法

1.1 材料 豬丹毒活疫苗活菌計數參考品由遼寧益康生物股份有限公司制備。活菌計數用馬丁瓊脂以及馬丁肉湯培養基由中海生物科技有限公司提供。活菌計數用馬血清、一次性吸管，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。培養皿購自青島金典生化器材公司。

1.2 方法

1.2.1 豬丹毒活疫苗活菌計數參考品的制備 采用豬丹毒桿菌弱毒株GC42制備一批(500瓶)豬丹毒活疫苗活菌計數參考品。按照現行《中國獸藥典》三部豬丹毒活疫苗質量標準對參考品的性狀、純粹檢驗、活菌計數、真空度測定、剩余水分等參數進行檢驗[6]。檢驗參數均合格后，隨機抽取100瓶，快遞至A單位、B單位和C單位，收到樣品后及時放入-70 ℃以下冰箱中保存。

1.2.2 培養基的篩選 委托中海生物科技有限公司采購來源不同的6個批次的豬胃。按照《中國獸藥典》二〇一五版附錄中配方，配制了6批相應的馬丁瓊脂以及馬丁肉湯培養基[7]。隨后隨機選取3瓶參考品，由2名檢驗員分別用6批次培養基對參考品進行計數并進行t檢驗以及穩健統計分析。根據結果選擇適宜的培養基，統一換成翻口膠塞后，隨機挑選100瓶馬丁肉湯和100瓶馬丁瓊脂，郵寄至B單位和C單位。

1.2.3 均一度檢驗 由2名檢驗員隨機抽取10瓶參考品進行計數，分析變異系數。

1.2.4 參考品的協作標定 依照《中國獸藥典》2015年版三部通則“生物制品國家標準物質制備和標定規定”，協作標定一共有A、B、C三家單位參加，每家單位2名檢驗員，每名檢驗員對3瓶參考品進行活菌計數，每瓶參考品進行2次重復試驗[8]。統計不同檢驗員在不同時間、不同實驗室活菌計數的結果。根據CNAS-GL02:2006《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》中穩健統計方法[9]，計算Z比分值，去掉了可疑及不滿意的數據，將剩余數據計算出平均值和標準差，并將平均值加減2個標準差作為定值范圍。

1.2.5 運輸穩定性試驗 考慮參考品在實際應用中會存在長距離運輸的情況，進行運輸過程的模擬，以評估參考品的穩定性。首先由A單位2名檢驗員隨機抽取3瓶參考品進行計數。隨后在夏季和冬季分別讓B、C兩家單位寄3瓶參考品至A單位(運輸條件為將樣品與生物冰袋放置在隔熱泡沫箱內，運輸時間48 h左右)，再由A單位2名檢驗員進行計數。

1.2.6 加速熱穩定性試驗 參考品保存溫度為-70 ℃，試驗中進行了加速熱穩定性試驗，以考核參考品在不同存放溫度下的穩定性。隨機抽取參考品，分別置于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃、-20 ℃條件下，每隔7 d隨機抽取3瓶進行活菌計數，共監測6周，評估參考品的穩定性。

1.2.7 參考品的保存期試驗 考慮到對保存期的延長有助于同批次參考品的應用，參考品的保存期被制定在了-70 ℃。每2個月對參考品進行一次標定，并與協作標定的數據進行比較。每3個月對參考品的剩余水分含量、真空度進行測定。每6個月對參考品的性狀、純粹性進行測定。與初始值進行比較，以探索參考品的保存期。

1.2.8 參考品在檢驗中的初步應用 在檢驗工作中對參考品進行了初步應用。同一名檢驗員在5個批次檢品的檢驗中均同時對參考品進行計數，作為結果判定的標尺。

2 結果

2.1 參考品的制備與檢驗 豬丹毒活疫苗活菌計數參考品性狀為海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加生理鹽水后迅速溶解。純粹檢驗結果為5/5純粹生長。真空度測定結果為5/5紫色輝光。剩余水分測定結果為2.2%、2.4%、2.2%、2.2%，均小于3.0%。活菌計數結果為9.8×108CFU/頭份。

2.2 培養基的篩選 a、b兩名檢驗員使用6批培養基對3瓶參考品計數(計數單位為×107CFU/頭份)，1號培養基計數結果為142、98、98、117、136、114；2號培養基計數結果為100、117、120、114、114、104；3號培養基計數結果為124、98、100、116、118、104；4號培養基計數結果為137、104、116、112、122、100；5號培養基計數結果為127、110、114、106、108、110；6號培養基計數結果為110、117、126、120、113、104。

分別將2、3、4、5、6號培養基的計數結果與1號培養基計數結果進行t檢驗，結果提示，相互之間沒有顯著差異，即6個批次的培養基質量無顯著差異。將每批次的培養基6個計數結果進行穩健統計分析，比對檢驗員數據的穩定性。1～6號培養基穩健分析結果(Z值)分別為1.0、-0.8、-1.5、0.5、3.4、2.7；-1.8、0.8、0.4、-0.3、-0.4、0；-0.1、-0.8、-1.3、0.3、0.4、0；0.7、-0.3、0、-1.1、1.1、-1.3；0.1、0.2、-0.1、-3.1、-1.5、1.7；-1.1、0.8、0.9、1.5、-0.5、-0.1。選擇檢驗員數據較為穩定的(Z值絕對值之和最小)3號培養基作為后續試驗所用的培養基。

2.3 均一度檢驗 2名檢驗員隨機抽取10瓶參考品進行計數(計數單位為×107CFU/頭份)。檢驗員a計數平均值為108，標準差為7.8，變異系數7%；檢驗員b計數平均值為106.5，標準差為6.8，變異系數為6%。2名變異系數均小于10%，說明樣品均一度良好。

2.4 協作標定 對3家單位協作標定結果進行穩健統計分析(計數單位為×107CFU/頭份)。A單位計數結果/Z值分別為99/-0.4、95/-0.8、103/-0.1、76/-2.3、91/-1.1、83/-1.8、124/1.6、137/2.8、120/1.3、122/1.5、116/1.0、104/0.0；B單位計數結果/Z值分別為101/-0.3、106/0.2、107/0.3、121/1.4、97/-0.6、96/-0.7、111/0.6、117/1.1、112/0.7、117/1.1、102/-0.2、104/0.0；C單位計數結果/Z值分別為96/-0.6、115/0.9、96/-0.6、102/-0.2、112/0.7、94/-0.9、99/-0.4、103/-0.1、109/0.4、102/-0.2、108/0.4、97/-0.6。

去掉2個可疑及不滿意的數據(Z絕對值大于等于2)，將剩下的34個數據計算出平均值(105)和標準差(10)，參考品每頭份含活菌數為8.5×108～12.5×108CFU。

2.5 運輸穩定性試驗 B、C兩家單位分別于2017年12月以及2018年7月寄3瓶參考品至A單位，A單位2名檢驗員對一共12瓶樣品進行計數(計數單位為×107CFU/頭份)。參考品夏季經過運輸后，2名檢驗員計數結果分別為98、95、89、90、83、89、101、95、106、92、105、97；冬季經過運輸后，2名檢驗員計數結果分別為96、97、90、89、99、101、112、101、95、103、98、95。計數結果均在參考品定值范圍內，說明在48 h內的運輸過程中參考品計數值可以保持穩定。

2.6 加速熱穩定性試驗 分別于第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天對保存于不同條件下的參考品進行計數，結果見圖1。

參考品在37 ℃保存7 d后，計數值降到協作標定的定值范圍之外；在25 ℃保存14 d后，計數值降到協作標定的定值范圍之外；在2～8 ℃保存參考品35 d后，計數值降到協作標定的定值范圍之外；在-20 ℃ 保存42 d后，計數值仍在協作標定的定值范圍內。加速穩定性試驗結果符合參考品的特性。

2.7 參考品的保存期試驗 分別于協作標定后第2、4、6、8、10、12、14、16月和18月由3家企業6名檢驗員按照對參考品進行計數，在穩健統計剔除不滿意數據后，對剩余數據的平均值和中位值進行了分析，結果見圖2。

圖1 參考品加速熱穩定性試驗Fig.1 Heat stability test of reference substance

圖2 參考品的保存期探索Fig.2 Retention period of reference substance

結果可見，每組數據的平均值和中位值均落在參考品的定值范圍內，說明參考品保存在-70 ℃其活菌值可在18月內保持穩定。

于第3、6、9、12、15月和18月對參考品的剩余水分含量、真空度進行測定；于第6、12月和18月對參考品性狀、純粹性進行測定。結果提示，參考品性狀、純粹性、剩余水分含量在-70 ℃保存條件下，在18個月內穩定；真空度在3個月后，出現部分失真空的現象。

2.8 參考品的初步應用 在檢驗工作中，對參考品進行了初步應用。同一名檢驗員在5個批次的檢驗中均用到了參考品。結果見表1。

4次檢驗結果為參考品以及待檢疫苗檢驗結果均合格。值得注意的是，在第5批次疫苗檢驗時，出現參考品不在賦值范圍內，但待檢疫苗合格的情況。出現這種情況，應該直接重檢還是判定合格，還值得討論。

表1 參考品的初步應用Table 1 Initial application of reference substance

3 討論

農業農村部于2018年5月19日正式啟動實施獸用抗菌藥使用減量化行動。獸用細菌類疫苗將逐漸取代抗生素，成為細菌類疫病防控的主力。細菌類疫苗的質量控制，是保證其發揮有效防控效果的關鍵。

在細菌類活疫苗的檢驗工作中，活菌計數是最基本的一個檢驗參數，通過對菌數進行測定，不僅能夠評價疫苗的免疫效力，還可以在效力檢驗免疫攻毒法中確定強毒攻毒的劑量。保障活菌計數結果的有效性和準確性，是細菌類生物制品檢驗工作的一個重點。為排除培養基和人員操作給活菌計數結果帶來的不確定性，使用活菌計數參考品，可以對檢驗過程進行監督，使檢驗結果更為準確[10]。

根據《中國獸藥典》三部通則“獸用生物制品國家標準物質制備和標定規定”、《中華人民共和國藥典》三部通則“生物制品國家標準物質制備和標定規程”[11]以及《國家藥品標準物質協作標定的技術要求與管理程序》[12]中對生物制品國家標準物質制備及標定的要求，本試驗對豬丹毒活疫苗活菌計數參考品進行了制備和標定。參考品的性狀、純粹性、活菌計數、剩余水分含量、真空度均符合《中國獸藥典》中豬丹毒活疫苗質量標準。由2名檢驗員對其均一性進行檢測，變異系數分別為7%和6%。通過協作標定，對參考品定值為每頭份含活菌數為8.5×108～12.5×108CFU。參考品在夏季和冬季由泡沫盒加冰袋的方式進行運輸不超過48 h，數值穩定；其性狀、純粹性、剩余水分含量、參考品菌數均可在18個月內可保持穩定。目前本實驗室仍在對本批次參考品的保存期進行監測，以期待可以延長其保存期。

由于本批參考品使用青瓶壓橡膠塞及卡鉑帽包裝，保存于-70 ℃時，出現了包裝口不再密閉而導致的失真空現象。然而由于保存條件穩定，失真空并未對剩余水分含量及菌數造成影響。為了確保參考品的真空度，在以后參考品的生產過程中可以考慮用安瓿分裝。在對參考品進行試應用時曾出現參考品計數結果不合格，但是待檢疫苗計數合格的現象。《美國獸醫生物制品法規和技術標準》內補充檢驗方法一章中規定，如果出現這種情況本次檢驗判定為無檢驗結果，采取企業內部質檢過程中的檢驗數據作為計數最終結果[10]。考慮到中國國情，這類判定方法在中國不適用，因此針對本參考品，如果出現這種情況，考慮判定為本次檢驗無效，應進行重檢。