泡囊短波單胞菌對鯽魚的病理組織學損傷

張 樺，王 利，李 娟，傅 芳

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041)

泡囊短波單胞菌(Brevundimonasvesicularis)是一種較罕見的非發酵性病原性假單胞菌，按照新版伯杰手冊，根據RNA同源性分類為假單胞菌科rRNA同源群4，為微小假單胞菌DNA同源群泡囊短波單胞菌[1]。該菌被認為有機會成為全球新型的機會致病菌，在宮頸炎、皮膚病、泌尿道疾病、血流感染、胸腔、心包腔及中樞神經系統等感染中均有發現[2-6]。在2010年，Popowska M等[7]發現土壤中存在著對四環素具有較高抗性的泡囊短波單胞菌。近年來，對泡囊短波單胞菌的研究主要集中在人類疾病上[8-11]，而在水生動物中僅有1例基于泡囊短波單胞菌對蘭·坎皮海龜的IgY滴度產生影響的研究[12]。

鯽魚(Carassiusauratus)是一種雜食性的淡水魚，為輻鰭魚綱鯉形目鯉科鯽屬的一種魚類[13-14]。由于鯽魚大規模養殖，且隨著養殖密度的不斷擴大，越來越多的疾病在魚身上暴發。其中細菌性疾病是最為嚴重的傳染性疾病，許多文獻報道的魚類細菌性病原主要包括普通變形桿菌、嗜水氣單胞菌和魯氏耶爾森氏菌等[15]；對魚類病理組織觀察也只是在細菌性敗血癥、嗜水氣單胞菌感染[16]。本試驗是以患病的黃顙魚中分離得到泡囊短波單胞菌菌株，人工感染鯽魚，探討其對鯽魚的病理組織學損傷，為魚類泡囊短波單胞菌的感染防控提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試驗菌株:于西南民族大學武侯校區第二實驗樓水族箱的患病黃顙魚中分離出的1株菌，命名為Z1，經鑒定為泡囊短波單胞菌，保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。(2)試驗動物:從成都某養殖場購置的健康鯽魚20尾，飼養于西南民族大學武侯校區第二實驗樓。鯽魚的體長(20±5)cm，體重為(250±5)g。眼觀體表完整、健康良好。(3)試驗試劑:LB培養基、瓊脂粉、多聚甲醛、甘油，購自成都市科龍化工試劑廠；二甲苯，購自天津市致遠化學試劑有限公司；無水乙醇，購自成都海興化工試劑廠；蘇木素染液、伊紅染液(醇溶)、中性樹膠，均購自合肥新恩源生物技術有限公司；1.1×T3 Super PCR Mix，購自北京天根生化科技有限公司；16S rDNA引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株懸浮液的制備 取保種的泡囊短波單胞菌Z1 100 μL接種于10 mL的LB液體培養基中，37 ℃，120 r/min培養12 h，于分光光度計中測定其OD600值。將測定的吸光度帶入其活菌數的OD600值標準曲線，得到菌液濃度。最后用0.85%的生理鹽水將菌液濃度調至5.0×107CFU/mL[17]。

1.2.2 動物試驗 試驗鯽魚在實驗室暫養1周，將其隨機分成對照組和試驗組，每組各10尾，飼養條件一致。在飼養期間均給鯽魚的正常生長條件，每天定時投喂飼料，3 d換水1次。參照1.2.1配制成的5.0×107CFU/mL的菌液，試驗組每尾給予0.2 mL的菌液腹腔注射，對照組給予同等體積的0.85%生理鹽水腹腔注射。觀察鯽魚的臨床癥狀并做好相關試驗記錄。

1.2.3 病理切片的制作 觀察鯽魚的精神狀況、食欲狀態、活動情況、死亡情況。對感染發病魚進行組織病理學觀察，即取感染發病魚的脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉，先固定于4%的多聚甲醛溶液中24 h以上，再分別于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ脫水1 h，隨后在二甲苯與無水乙醇的1∶1混合溶液中透明15 min，再在二甲苯中透明20 min，最后浸蠟、包埋、切片和H.E.染色。試驗期間做好臨床癥狀、剖檢癥狀、病理組織癥狀的記錄。

1.2.4 細菌的分離鑒定 在無菌環境下，用接種環分別穿刺試驗組感染發病魚的脾臟、肝臟、腎、心臟和腹腔積液，劃線于LB固體培養基，于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。之后對平板里的菌按照常規操作進行分離和純化，挑取形狀、顏色、大小相近的單菌落并命名為Z2，于LB液體培養基中37 ℃，180 r/min 培養12 h。運用16S rDNA通用引物對分離到的Z2菌進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，有目的條帶，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

2 結果

2.1 臨床癥狀 在感染24 h后，試驗組鯽魚開始出現精神不佳、活動能力減弱、食欲減退、體表黏液增多、皮膚泛黃、局部出血、肛門紅腫、魚鰭基部有出血點、爛尾、魚鱗脫落、腹部腫脹、體表充血等臨床癥狀(見中插彩版圖1)。48 h后，感染魚開始出現死亡。對照組無病理變化現象。

2.2 剖檢癥狀 對發病魚進行剖檢，眼觀均表現為皮下局部肌肉呈彌散性出血，腹部有大量積液；肝、胰臟顏色變深、腫大并伴有樹枝狀出血現象；腎臟易發生溶解且腎體積腫脹并伴隨有充血現象；脾臟腫大，顏色變深、變暗(見中插彩版圖2)。

2.3 病理組織學觀察 經光學顯微鏡觀察，受感染鯽魚的肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、心臟均呈現出不同的病變情況，組織或者細胞基本都發生腫脹、充血、變性、壞死等主要病理變化(見中插彩版圖3)。肝臟經光學顯微鏡觀察可知：肝細胞發生水腫變性且失去原有的細胞形態，細胞核體積增大并且部分細胞核被擠壓到細胞的一側，細胞質可見大小不一的空泡，肝血竇擴張充血，肝組織中有少量炎性細胞浸潤(見中插彩版圖3A)。脾臟經光學顯微鏡觀察可知：脾臟組織結構疏松，淋巴細胞數量相對減少，紅細胞數量相對增多且幾乎覆蓋整個脾臟組織。脾臟組織中還可見含鐵血黃素的沉積，提示脾臟有溶血現象。脾竇擴張出血，脾白髓的淋巴細胞變性(見中插彩版圖3B)。腎臟經光學顯微鏡觀察可知：腎臟組織中炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹并伴隨有玻璃樣變性，細胞核體積增大，從組織切片中還可以看出腎小管上皮細胞有脫落現象。腎小球中充滿紅細胞，腎小管間質增厚，并有大量的紅細胞充盈期中，即發生了毛細血管閉鎖的現象。腎小管的管腔變狹窄，并有些腎小管的管腔中充斥著透明管型(見中插彩版圖3C)。心臟經光學顯微鏡觀察可知：心肌細胞腫脹，細胞核濃縮，出現透明變性，細胞間隙變寬，心肌纖維呈不規則波浪狀條紋并且部分心肌纖維發生斷裂(見中插彩版圖3D)。肌肉組織經光學顯微鏡觀察可知：肌細胞間隙增大且有紅細胞出現，肌纖維有斷裂現象且排列紊亂(見中插彩版圖3E)。

2.4 細菌的鑒定 分離的Z2菌16S rDNA基因擴增結果見圖4，測序所得基因的片段長度為1 375 bp。經NCBI的BLAST比對之后發現其與泡囊短波單胞菌266XY4株的一致性最高，為98%，該菌為泡囊短波單胞菌，與注射菌株一致，從而判斷該菌株可引起鯽魚致病。

圖4 保種菌和分離菌的基因擴增產物Fig.4 Gene amplification products of preserved and isolated bacteriaM：DL-2 000 DNA Marker；1：泡囊短波單胞菌菌株Z1；2：感染魚中分離菌株Z2M:DL-2 000 DNA Marker;1:Brevundimonas vesicularis strain Z1;2:Strain Z2 isolated from infected fish

3 討論

泡囊短波單胞菌又名泡囊假單胞菌，是一種較罕見的非發酵性病原性假單胞菌。1994年，Segers等[18]將其劃歸于短波單胞菌屬。2018年，Ryan M P等[2]將其描述為一種新出現的全球條件致病菌。目前國內外學者對泡囊短波單胞菌的研究主要集中在人體臨床感染等方面，2001年，于愛民等[19]從新生兒患者血標本中分離到1株泡囊短波單胞菌，發現其能致敗血癥并伴有抽搐、青紫等臨床現象。2003年，魏麗等[20]首次從臨床患者的尿液中分離出1株泡囊短波單胞菌，發現其能致尿路感染并伴有發熱、尿頻、尿急、尿不盡等臨床癥狀。2007年，馬學斌等[21]發現泡囊短波單胞菌能致關節腔感染并導致其腫大。2018年，Christiadi D等[8]報道了由泡囊短波單胞菌引起腹膜炎的治療。泡囊短波單胞菌的致病性通常發生于自身免疫系統發育不完善、免疫力低下、大量應用廣譜抗菌藥物、皮質激素以及免疫抑制治療后的人群。本試驗將該菌通過腹腔注射至鯽魚腹腔組織，通過血液循環感染各組織，導致各組織出現變性、腫脹、出血等現象。由此分析鯽魚快速死亡的原因可能有以下3點：(1)鯽魚受到內外環境變化的刺激以及受到致病菌的感染，導致體內內環境穩態失衡，免疫力下降；(2)鯽魚受到致病菌的感染，導致體表出血、潰爛，從而增大鯽魚被其他一些致病菌感染的機會；(3)鯽魚受到致病菌的感染，導致鯽魚的各組織出現病理損害。這表明該菌對鯽魚有致病性。

本試驗中，發病鯽魚的臨床癥狀與患病的黃顙魚的臨床癥狀相似，如魚鰭基部有充血、出血、紅腫、潰爛現象，皮膚有出血點、肛門有紅腫、腹部腫大等，這與任思宇等[22]的1例鯽魚細菌性敗血癥的病原學和病理學研究相似。通過光學顯微鏡觀察鯽魚各組織病理切片，發現受感染鯽魚的心臟、腎臟、脾臟、肝臟和肌肉都有不同程度的損壞。心臟心肌纖維排列紊亂，心肌細胞間隙增大。腎臟的腎小管上皮細胞腫脹、脫落、變性、出血、炎性細胞浸潤，這與申會剛等[23]的鯽魚嗜水氣單胞菌感染后脾、腎、肝的組織學病變及吞噬細胞的變化相似。脾臟的紅細胞數量增多，含鐵血黃素的沉積，這與趙靜等[16]黃顙魚感染小腸結腸炎耶爾森菌的脾臟病變有所區別。肝臟組織結構疏松，出血，肝細胞腫脹變性，這與曾燕玲等[14]鯽魚感染嗜水氣單胞菌的癥狀相似,與蔣自立等[15]嗜水氣單胞菌感染黃顙魚肝組織病變有所區別。肌肉組織的肌纖維排列紊亂，間隙增大。

綜上所述，本文探討了泡囊短波單胞菌對鯽魚各組織器官的病理性損傷，這將有利于為魚類泡囊短波單胞菌的感染防治提供科學參考。