穩定表達犬瘟熱病毒基質蛋白的細胞系Vero-SLAM-M的構建

林佳旭，王介淞，楊雅明，黃 娟，單 虎

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

犬瘟熱 (Canine distemper，CD) 是一種可導致多種動物共患的高度接觸性傳染病，在自然條件下，最為易感的動物以犬科、鼬科、貓科等肉食獸為主，感染后的死亡率極高。其病原犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae) 麻疹病毒屬(Morbillivirus)[1]，為有囊膜的單股負鏈 RNA 病毒，主要編碼有 6 個結構蛋白，其中，基質蛋白(Matrix protein,M)是最小的結構蛋白，約為 37 kD，具有高度保守性[2]，在病毒的感染中起到極其重要的作用[3]。

免疫接種是目前防制犬瘟熱的主要手段，滅活苗對CDV強毒攻擊不能提供完全的保護，因此，弱毒活疫苗被廣泛應用于犬和經濟動物犬瘟熱的防制。商品化犬瘟熱弱毒疫苗的疫苗毒株多是通過將分離的強毒株經異種動物(雪貂等)、雞胚或細胞連續傳代以致弱，如CDV/R-20/8株、Onderstepoort株等，但是這種致弱方法獲得的弱毒株存在毒力返強的風險，而且疫苗株對野生動物有不同程度的致病性[4]；少數商品化犬瘟熱弱毒疫苗的疫苗毒株是從自然界分離篩選獲得的自然弱毒株，如用于狐貍的CDV-11株，是從體溫一過性升高的犬分離獲得，對犬、貉、水貂、狐貍均安全[5]，但該疫苗株在動物體內可自主復制，在免疫接種時存在散毒風險，對野生動物的安全性也未知。與傳統致弱方式相比，以反向遺傳學為基礎，利用病毒拯救及點突變毒力相關位點的方法獲得減毒株，具有病毒致弱方式明確、疫苗更加安全等優點[6-8]；將病毒基因組某個復制必須蛋白基因缺失，獲得病毒復制缺陷毒株，該毒株只能在提供該蛋白的細胞上復制，在其他細胞或動物體內均無復制性，已經在其他負鏈病毒，如水泡性口炎病毒獲得成功[9]。CDV M蛋白既是復制必須蛋白，也是毒力相關蛋白[10-12]，是構建CDV復制缺陷毒株的理想靶蛋白。

本試驗旨在建立一種能穩定表達狐貍源犬瘟熱病毒 M 蛋白的細胞系，該細胞系可為后續CDV復制缺陷毒株的拯救提供復制許可細胞，也可為CDV M 蛋白功能的進一步研究提供一種過表達細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、細胞、犬瘟熱病毒及陽性血清 質粒pCI-neo、質粒pEGFP-N1、Vero-SLAM 細胞、狐貍源犬瘟熱病毒分離毒株SD16F、犬源犬瘟熱病毒陽性血清均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器XhoI 和NotI 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶和ExTaq酶等，均購自 TaKaRa 公司；無內毒素質粒小量提取試劑盒、DMEM 培養基、G418 硫酸鹽溶液，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；轉染試劑Lipo2000，購自Invitrogen 公司；兔抗犬 IgG 二抗，購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒 pCI-neo-M 的構建

1.2.1.1 PCR 擴增 根據本實驗室保存的犬瘟熱流行毒株 SD16F 的核苷酸序列，應用Primer 5.0 軟件在保守區設計上、下游引物，SD16F-M-F：5′-CCGCTCGAGGCCACCATGACTGAGGTGTACGACTT-CG-3′；SD16F-M-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAGAATTTTGAAAAGACCCTG-3′，序列中有下劃線的部分為XhoI 和NotI 酶切位點，有黑色加粗下劃線的部分為 Kozak 序列，以犬瘟熱流行毒株 SD16F 為模板，進行 PCR 擴增。PCR 反應體系為:dNTP 2 μL、M上游引物 1 μL、M下游引物 1 μL、cDNA 2 μL、ExTaq酶 0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、ddH2O 16 μL。擴增程序為:94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共 30個循環；72 ℃終延伸 10 min。

1.2.1.2 載體的構建與鑒定 PCR 產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，經膠回收后，膠回收產物與 pCI-neo 載體同時經XhoI 和NotI 限制性內切酶雙酶切，T4連接酶連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，挑取單個菌落搖菌培養后，進行菌液 PCR 鑒定，鑒定為陽性的菌液提取重組質粒，經酶切鑒定為陽性的重組質粒，經測序驗證序列正確。陽性重組菌大量培養后經無內毒素質粒小量提取試劑盒提取質粒使其達到可轉染細胞用標準，檢測質粒濃度后，標記放置于-80 ℃ 冰箱待用。

1.2.2 細胞瞬時轉染及M基因表達鑒定

1.2.2.1 細胞轉染 轉染前1天，取生長狀態良好，細胞密度適宜的 Vero-SLAM 細胞鋪 96 孔板，待細胞密度達到 85% 左右，將 pCI-neo-M 重組質粒用無血清 opti-MEM 培養液做適當稀釋后，參照轉染試劑 Lipo2000 說明書，以0.2 μg/孔劑量轉染至 96 孔細胞培養板中，并設置 pEGFP-N1 對照孔、pCI-neo 空質粒對照孔、脂質體對照孔和未轉染細胞對照孔。轉染后的細胞在 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2.2 RT-PCR 鑒定 轉染細胞 48 h 后，在倒置顯微鏡下觀察空質粒轉染組和脂質體轉染組細胞無異常，在倒置熒光顯微鏡下觀察 pEGFP-N1 對照孔有綠色熒光，表明轉染試驗成功。提取 pCI-neo-M 轉染孔、細胞對照組孔細胞總 RNA，經DpnI 酶處理后進行 RT-PCR 試驗檢測目的蛋白的轉錄。

1.2.2.3 間接免疫熒光鑒定 以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗狗 IgG 為二抗對 pCI-neo-M 轉染組、未轉染細胞對照組進行 IFA 試驗驗證 M 蛋白的表達情況。

1.2.3 Vero-SLAM-M 細胞系的構建

1.2.3.1 細胞 G418 篩選濃度的確定 取傳代后生長狀態良好、細胞密度適宜的 Vero-SLAM 細胞經胰酶消化后，使用細胞計數板計數，鋪滿 24 孔板，細胞數為 2×104個/孔，培養過夜后吸去細胞培養液，用PBS清洗細胞2次，每孔加入含有不同濃度梯度 G418 的 DMEM 篩選培養基(濃度依次為 0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μg/mL和1 100 μg/mL)，每個梯度設 2 個重復孔。每 3 d 更換1次篩選培養基，連續培養 10～14 d，每天觀察記錄細胞的死亡情況，以第 10 天細胞全部死亡的最低 G418 濃度為 Vero-SLAM 的最適篩選濃度。

1.2.3.2 細胞轉染及克隆篩選 按“1.2.2.1”步驟以 2 μg/孔的劑量將 pCI-neo-M 重組質粒轉染至 6 孔板 Vero-SLAM 細胞中。轉染后的 Vero-SLAM 細胞培養 3 d 后更換含最適 G418 篩選濃度的 DMEM 篩選培養基，每 3 d 換新的篩選培養基，連續培養 12 d。每天觀察細胞的生長狀態，待對照孔細胞達到 90% 以上死亡時，用胰酶消化存活的 Vero-SLAM 細胞，適當稀釋后傳入 25 cm2細胞培養瓶中。如此連續克隆陽性細胞 3 次，篩選2～3株 可穩定表達M的 Vero-SLAM 細胞 G418 抗性克隆株。將陽性細胞克隆株更換為一半最適 G418 篩選濃度的 DMEM 培養基連續傳代 10 次以上，按常規方法凍存、復蘇，觀察該抗性克隆株傳代的穩定性。

1.2.3.3 M 基因轉錄及蛋白表達水平的檢測 選取 1 株 Vero-SLAM-M 細胞克隆株的第 F5、F10 代細胞提取總RNA，按照“1.2.2.2”方法對克隆株進行 mRNA 水平檢測；以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗犬 IgG 為二抗對 Vero-SLAM-M 細胞克隆株F10代按“1.2.2.3”方法進行 IFA 試驗驗證 M 蛋白的表達情況，同時設置未轉染重組質粒pCI-neo-M 的 Vero-SLAM 細胞作為陰性對照組。

1.2.3.4 細胞生長曲線測定 取傳代后生長狀態良好、密度適宜的 Vero-SLAM-M 細胞系經胰酶消化后，使用細胞計數板計數，鋪24孔板，細胞數為 2×104個/孔，共18孔。連續培養細胞至 6 d，每培養24 h取3孔細胞計數取平均值。同時設其親本 Vero-SLAM 細胞對照，根據計數結果繪制細胞一步生長曲線。

2 結果

2.1 pCI-neo-M 表達載體構建 以狐貍源犬瘟熱流行毒株 SD16F 為模板，按方法“1.2.1.1”PCR 擴增獲得與預期大小(1 008 bp)相符目的片段(圖1)。該片段克隆至 pCI-neo 質粒，經XhoI 和NotI 限制性內切酶雙酶切后，獲得大小約為 1 008 bp和5 427 bp的2個條帶(圖2)，測序結果表明，真核表達載體構建成功，并命名為pCI-neo-M。

2.2M基因的瞬時表達 pCI-neo-M 重組質粒瞬時轉染Vero-SLAM細胞后，提取細胞總RNA，RT-PCR擴增獲得與預期大小(1 008 bp)相符目的片段(圖3)。經 IFA 試驗驗證，pCI-neo-M轉染組細胞在熒光顯微鏡下觀察有特異性綠色熒光(封三彩版圖4)，表明pCI-neo-M質粒能在Vero-SLAM細胞中表達M蛋白。

圖1 M 基因的擴增結果Fig.1 Amplification results of M geneM：DL-2 000 DNA 分子量標準；1～2：M 基因的PCR 產物；3：陰性對照M:DL-2 000 DNA Marker;1～2:PCR product of M gene;3:Negative control

圖2 重組質粒酶切鑒定結果Fig.2 Digestion results of recombinant plasmidM1：DL-10 000 DNA 分子量標準；M2：DL-5 000 DNA 分子量標準；1：重組質粒用 Xho I/ Not I 酶雙酶切；2：重組質粒用 Xho I 酶單酶切M1:DL-10 000 DNA molecular weight standard;M2:DL-5 000 DNA molecular weight standard;1:Recombinant plasmid digested by Xho I/ Not I；2:Recombinant plasmid digested by Xho I

圖3 RT-PCR鑒定M 基因的轉錄Fig.3 Expression of M gene identified by RT-PCRM：DL-2 000 DNA 分子量標準；1：轉染空質粒的Vero-SLAM細胞；2：轉染重組質粒的Vero-SLAM細胞M:DL-2 000 DNA Marker;1:Vero-SLAM cells transfected with pCI-neo;2:Vero-SLAM cells transfected with pCI-neo-M

2.3 G418 最適濃度測定結果 Vero-SLAM 細胞加入不同梯段濃度G418培養液后，從第2天起500 μg/mL及以上濃度篩選組均有少量細胞死亡。篩選至10 d，300 μg/mL組達到40%細胞死亡，700 μg/ mL組達到90%細胞死亡，超過900 μg/mL各組細胞均已全部死亡(封三彩版圖5)，確定Vero-SLAM 細胞對G418最適篩選濃度為 900 μg/mL。

2.4 Vero-SLAM-M 細胞系的構建 對G418篩選細胞克隆株的F5、F10代進行M基因 mRNA 的 RT-PCR 檢測，結果顯示均擴增得到1 008 bp特異性陽性條帶(圖6)，證明 F5、F10 代均有M基因的轉錄。以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗犬IgG為二抗的間接免疫熒光試驗證明M基因在細胞克隆株的F10 代仍有蛋白水平的表達(封三彩版圖7)。將該穩定表達M蛋白的細胞株命名為 Vero-SLAM-M 細胞。

圖6 pCI-neo-M穩定轉染細胞后的RT-PCR鑒定Fig.6 Identification of pCI-neo-M in stably transfected cells by RT-PCRM：DL-2 000 DNA 分子量標準；1：pCI-neo-M穩定轉染Vero-SLAM細胞(F5 代)；2：pCI-neo-M穩定轉染Vero-SLAM細胞(F10 代)M:DL-2 000 DNA Marker;1:The F5 passage of Vero-SLAM cells transfected stably with pCI-neo-M;2:The F10 passage of Vero-SLAM cells transfected stably with pCI-neo-M

2.5 Vero-SLAM-M 細胞系生長曲線 Vero-SLAM-M 細胞系連續傳代 10 代以上，經過凍存、復蘇后，該細胞系的生長周期、細胞傳代后的狀態依然較為穩定。通過細胞培養和細胞生長曲線發現，該細胞系與其親本 Vero-SLAM 細胞生長特性基本保持一致(圖8)。

3 討論

利用脂質體轉染技術和 G418 藥物篩選技術，成功構建出了可穩定表達犬瘟熱病毒M基因的 Vero-SLAM-M細胞系。為了有效的提高M基因的表達水平，本試驗在M基因上游引入了能增強蛋白翻譯功能的Kozak序列[13]。本試驗選用的載體pCI-neo，為新霉素篩選標記，是不帶EGFP熒光蛋白的載體，因此無法借助其表達的強綠色熒光來輔助細胞克隆的挑選純化。但表達載體與Vero-SLAM細胞基因組完成隨機重組后 EGFP 蛋白表達是無法直接反映出M基因表達量的，因此仍需借助IFA試驗來完成M基因蛋白表達量的鑒定[14]。因本實驗室尚未獲得針對M蛋白的特異性單克隆或多克隆抗體，本試驗采用犬源犬瘟熱病毒陽性血清作為一抗，兔抗犬 IgG 作為二抗，通過間接免疫熒光試驗驗證了M蛋白的瞬時表達和穩定表達。

圖8 Vero-SLAM-M 細胞系和 Vero-SLAM 細胞系一步生長曲線Fig.8 Growth curve of the Vero-SLAM-M cells and Vero-SLAM cells

本試驗收集了 Vero-SLAM-M 細胞系 F5、F10代及其親本Vero-SLAM 細胞，分別提取細胞總 RNA 后進行 RT-PCR 試驗，試驗結果證明，M基因在該 Vero-SLAM-M 細胞克隆株的 F5、F10 代次中均有轉錄水平的表達。以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗犬 IgG 為二抗的間接免疫熒光試驗證明，M基因在該 Vero-SLAM-M細胞克隆株的 F10 代仍有蛋白水平的表達。繪制 Vero-SLAM-M 細胞系與其親本 Vero-SLAM 細胞系生長曲線測定結果顯示，2種細胞系在生長特性及生長周期等方面基本保持一致，Vero-SLAM-M 細胞系培養到第4天時進入對數生長期，5 d 時進入細胞生長平臺期。在培養的1～5 d 中帶M基因重組質粒的細胞系生長情況與親本細胞差異并不大，但在第5天當其達到細胞數量的頂峰后，帶有重組質粒的細胞系凋亡速度明顯慢于普通親本細胞，且細胞數量的頂峰值要高于親本細胞，推測產生此現象的原因可能是 G418 的壓力作用導致 Vero-SLAM-M 細胞生長密度增加，且細胞更為耐受。

雖然國內外研究人員陸續研制出不同類型的犬瘟熱疫苗[15]，但目前仍多依賴于弱毒疫苗對犬瘟熱進行預防，但弱毒苗在使用過程中存在著一定的缺陷，例如毒力返祖、極易引起一過性免疫抑制、首免易受母源抗體干擾等情況[16]，還會促進CDV野毒的基因進化[17]。因此，近些年更多的研究人員致力于尋求更為安全有效的新型疫苗。隨著分子生物學技術和基因工程技術的深入發展與廣泛應用，犬瘟熱病毒新型疫苗得到廣泛的研制與發展，如基因工程亞單位疫苗及重組活載體疫苗等[18-19]，新型疫苗的開發極大的克服了常規疫苗的不足。本試驗建立的細胞系為后續犬瘟熱病毒致病機制的研究帶來了極大的方便，也為犬瘟熱病毒 M 蛋白的功能測定及新型犬瘟熱基因工程疫苗的研制創造了便利條件。