3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定大米中水溶性糖含量

王莉麗 梅文泉 陳興連 方海仙 劉興勇 楊東順 王衛(wèi)清

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，昆明 650223)

食品中含有多種糖類，包括具有還原性的葡萄糖、果糖、麥芽糖，也有不具有還原性的蔗糖[1]。大米是一種食品，在人類的飲食結(jié)構(gòu)中占有舉足輕重的地位。以前對(duì)大米中淀粉和蛋白質(zhì)測(cè)定研究較多[2-4]。在大米品種育種和質(zhì)量檢驗(yàn)中，有時(shí)要求測(cè)定其還原糖與蔗糖的總量，即水溶性糖含量。建立大米中水溶性糖含量的測(cè)定方法，對(duì)于鑒定大米品種、評(píng)價(jià)大米品質(zhì)、保障大米質(zhì)量具有重要意義。一般水溶性糖的測(cè)定方法有滴定法[5,6]，3，5-二硝基水楊酸比色法[7,8]、蒽酮比色法[9,10]、苯酚-硫酸比色法[11]、高效液相色譜法[12]等。本文在參考以上有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定大米中水溶性糖含量的方法。方法測(cè)量范圍寬、準(zhǔn)確度和靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單、快速，具有參考價(jià)值。有關(guān)采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定大米中水溶性糖的方法鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

20%乙酸鋅溶液：稱取100 g乙酸鋅(分析純)，加15 mL冰乙酸(分析純)，加蒸餾水溶解并稀釋至500 mL。

10%亞鐵氫化鉀溶液：稱取50.0 g亞鐵氫化鉀(分析純)，加蒸餾水溶解并稀釋至500 mL。

6.0 mol/L鹽酸溶液：取250 mL蒸餾水，置于500容量瓶中，緩慢加入250 mL鹽酸(優(yōu)級(jí)純)。

6.0 mol/L 氫氧化鈉溶液：稱120 g氫氧化鈉(分析純)，置于100 mL 燒杯中，用約70 mL蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：葡萄糖(分析純)于105 ℃烘箱中烘至恒重，取出放入干燥器中冷卻后稱0.500 0 g，置于500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，即配成濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3,5-二硝基水楊酸溶液: 3.25 g 3,5-二硝基水楊酸(分析純)溶于少量水中，移入500 mL容量瓶中，加2 mol/L氫氧化鈉溶液325 mL，再加入45 g丙三醇(分析純)，搖勻，定容。

甲基紅指示劑：稱取0.1 g甲基紅(分析純)溶于50 mL 95%乙醇(分析純)。

1.1.2 儀器

HR2839型組織搗碎機(jī)，BSA224S-CW型電子分析天平，ELGA CENTRA R200型純水系統(tǒng)，SHA-CA型水浴恒溫振蕩器，specord210plus型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

提取：大米樣品在組織搗碎機(jī)中搗碎，過(guò)60目篩。稱取大米樣品8.00 g，置100 mL容量瓶中，加水至70 mL左右，60 ℃水浴中提取0.5 h，其間每過(guò)10 min搖動(dòng)1次。取出立即先加入5 mL乙酸鋅溶液，搖勻后再加入5 mL亞鐵氫化鉀溶液，搖勻冷卻后定容，過(guò)濾，濾液備用。

水解[13]：準(zhǔn)確移取濾液50 mL，置于100 mL容量瓶中，加入5 mL濃度為6.0 mL鹽酸，70 ℃水浴中水解15 min，取出冷卻后，加2滴甲基紅指示劑，用6.0 mol/L氫氧化鈉溶液中和水解液至紅色消失，用水定容，搖勻后用于比色。

比色：準(zhǔn)確吸取水解液1.0 mL于10 mL比色管中，加入3，5-二硝基水楊酸試劑1.0 mL，混合均勻后沸水中加熱6 min，取出迅速用流水冷卻，加水定容至10 mL；在1.0 mL去離子水中加入1.0 mL 3，5-二硝基水楊酸作相同加熱處理后用于分光光度計(jì)的調(diào)零。540 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大米中水溶性糖的含量。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用移液管準(zhǔn)確吸取0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10 mL試管中，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0 mL，加3,5-二硝基水楊酸溶液1.0 mL，搖勻后按1.2.1比色。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中葡萄糖含量(mg)作橫坐標(biāo)，吸光度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)做試劑空白。

1.2.3 計(jì)算公式

大米中水溶性糖含量按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：ω為大米中水溶性糖含量/%；m1為大米稱樣量/g；m2為樣品溶液吸光度值減去試劑空白的吸光度值后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的水溶性糖含量/mg；V1為提取體積/mL；V2為分取體積/mL；V3為最后定容體積/mL；V4為用于比色的樣液體積/mL；100為換算為百分含量的系數(shù)；1 000為將g換算為mg的系數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)條件下，m1為8.00 g，V1為100 mL，V2為50.0 mL，V3為100 mL，V4為1.0 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

實(shí)驗(yàn)中加入的3，5-二硝基水楊酸與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物3-氨基-5硝基水楊酸[14]。在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定波長(zhǎng)有490、520、540、580 nm等[15-18]，其最佳波長(zhǎng)的確定受到儀器性能、靈敏度、實(shí)驗(yàn)樣品和3，5-二硝基水楊酸顯色劑等因素的影響[19]。為了確定測(cè)定大米中水溶性糖的最佳波長(zhǎng)，在450～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)3，5-二硝基水楊酸和葡萄糖經(jīng)顯色后進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3，5-二硝基水楊酸和葡萄糖掃描曲線

由圖1可知，葡萄糖掃描曲線最大吸收波長(zhǎng)為500 nm。為了提高檢測(cè)靈敏度，通常選取最大吸收峰處的波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。但從3，5-二硝基水楊酸溶液掃描曲線可以看出，在500 nm波長(zhǎng)下，3，5-二硝基水楊酸具有約0.5的吸光度值，會(huì)對(duì)測(cè)定葡萄糖產(chǎn)生較大干擾。當(dāng)波長(zhǎng)為540 nm時(shí)，干擾最小。因此將540 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 提取和顯色條件實(shí)驗(yàn)

2.2.1 樣品稱樣量

對(duì)同一樣品分別稱取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g樣品，然后按1.2測(cè)定水溶性糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，測(cè)定結(jié)果與稱樣量有較大的關(guān)系，當(dāng)稱樣量為8.00 g時(shí)，測(cè)定結(jié)果最大，因此本實(shí)驗(yàn)選取稱樣量為8.00 g。

圖2 不同稱樣量的大米水溶性糖含量

2.2.2 樣品粉碎粒度

同一份大米樣品在組織搗碎機(jī)中搗碎，分別過(guò)20、40、60、80、100目篩，然后按1.2.1測(cè)定不同粉碎粒度的大米吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，過(guò)60目篩樣品吸光度最大，繼續(xù)增大目數(shù)吸光度值不再增加。因此本研究實(shí)驗(yàn)中將粉碎后過(guò)60目篩的大米樣品用于測(cè)定。

2.2.3 提取溫度

選擇50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0 ℃不同提取溫度提取后測(cè)定同一樣品的吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，提取溫度較低時(shí)，大米中可溶性糖的提取率較低。提取溫度過(guò)高，提取率也較低。淀粉作為大米中的主成分，其含量占大米干基的90%以上[20]，提取溫度升高后，大米中淀粉糊化,其淀粉顆粒在水中受熱吸水膨脹，使樣液的黏度增大[21]，影響提取液的制備。當(dāng)溫度為60.0 ℃時(shí)，樣液提取效果最佳。因此本研究實(shí)驗(yàn)選擇60.0 ℃作為提取溫度。

圖3 提取和顯色條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 乙酸鋅溶液和亞鐵氫化鉀溶液加入量

結(jié)果表明加入乙酸鋅溶液和亞鐵氫化鉀溶液各5.0 mL時(shí)，大米中蛋白質(zhì)的沉淀效果較好，得到的樣品溶液透明澄清，故本實(shí)驗(yàn)選擇加入各5.0 mL的乙酸鋅溶液和亞鐵氫化鉀溶液。

2.2.5 3，5-二硝基水楊酸加入量

選擇0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.2和1.4 mL不同加入量測(cè)定同一樣品的吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)加入量為1.0 mL時(shí)，吸光度最大，繼續(xù)增加3，5-二硝基水楊酸用量吸光度不再增加，因此，本研究實(shí)驗(yàn)選擇3，5-二硝基水楊酸加入量為1.0 mL。

2.2.6 煮沸反應(yīng)時(shí)間

選擇煮沸反應(yīng)時(shí)間1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，煮沸加熱時(shí)間需大于5 min，3，5-二硝基水楊酸才能與樣液中的可溶性糖完全反應(yīng)，并得到穩(wěn)定的橘紅色比色液。因此，本研究實(shí)驗(yàn)選擇煮沸加熱時(shí)間6 min。

2.2.7 樣液穩(wěn)定時(shí)間

對(duì)煮沸后樣液的穩(wěn)定性做實(shí)驗(yàn)對(duì)比，選擇放置0.17、0.5、1.0、4.0、10、15 h和20 h測(cè)定同一樣品的吸光度，結(jié)果圖3。由圖3可知，可溶性糖與顯色劑反應(yīng)生成的橘紅色溶液在4 h內(nèi)保持穩(wěn)定。故應(yīng)在顯色反應(yīng)后4 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.2測(cè)定不同濃度葡萄糖對(duì)應(yīng)的吸光度值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，在測(cè)定范圍內(nèi)的葡萄糖含量與其對(duì)應(yīng)的吸光度值之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=0.968 2X+0.014 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定

品種為清馥臻稻的大米樣品搗碎后過(guò)60目篩，稱取12份，每份8.00 g，分為4個(gè)組，每組3份。第一組按1.2測(cè)定水溶性糖含量，取平均值作為本底值；第二組加入葡萄糖10 mg，即添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%；第三組加入葡萄糖50.0 mg，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%；第四組加入葡萄糖200 mg，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%。即添加低、中、高3個(gè)濃度。按1.2測(cè)定水溶性糖含量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，添加0.10%、0.50%和2.0%的加標(biāo)回收率平均值為91.9%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.68%～2.79%，說(shuō)明該方法用于測(cè)定大米中水溶性糖具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定結(jié)果

2.3.3 方法檢出限的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[22]分光光度法測(cè)定方法檢出限：按照樣品分析的全部步驟，重復(fù)10次空白實(shí)驗(yàn)，計(jì)算方法檢出限，結(jié)果為0.003%。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用所建立的方法，對(duì)采自云南各地的10份大米中的水溶性糖含量進(jìn)行了測(cè)定。10份大米名稱、產(chǎn)地和測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大米水溶性糖含量測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果10份大米水溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%～1.95%。10份大米中有秈米6份，粳米2份，糯米2份。6份秈米的水溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%～0.61%；2份粳米的分別為0.45%和1.11%；2份糯米的分別為0.74%和1.95%。

10份大米中水溶性糖含量最低為0.12%。按2.3.3測(cè)定本文方法檢出限為0.003%，建立的方法完全滿足測(cè)定大米中水溶性糖時(shí)對(duì)靈敏度的要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了3，5二硝基水楊酸比色法測(cè)定大米中水溶性糖含量的方法。在優(yōu)化的提取和顯色條件下，高、中、低3個(gè)添加濃度的加標(biāo)回收率為91.9%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.68%～2.79%，檢出限為0.003%。方法測(cè)定范圍寬、準(zhǔn)確度和靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單、快速，主要試劑3,5二硝基水楊酸在一般試劑商店就能買到,比較容易推廣。對(duì)6份秈米、2份粳米和2份糯米共10份大米中的水溶性糖含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果10份大米中水溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%～1.95%。