氣相色譜質譜聯用法測定飼料原料中16種多環芳烴

張艷紅 李德祥 張鳳枰 鄒昌健

(四川威爾檢測技術股份有限公司1，成都 610041) (通威股份有限公司水產畜禽營養與健康養殖農業農村部重點實驗室2，成都 610093) (通威股份有限公司水產健康養殖四川省重點實驗室3，成都 610093)

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上苯環的烴類化合物，是煤、石油、木材、煙草等的有機高分子化合物不完全燃燒時產生的，具有生物累積性、不易降解等特點，具有致畸、致癌、致突變作用[1-3]。美國國家環境保護總署(EPA)把其中16種多環芳烴列入優先控制污染物名單[4]，2005年歐盟發布的《關于多環芳香烴的指令》(PAHs指令2005/69/EC)限制包含苯并芘(Bap)在內的16種多環芳烴的使用。大氣、土壤和水體中的多環芳烴易被植物吸收，通過食物鏈的富集并傳遞，最終到達食物鏈高端的哺乳動物等生物體內，從而影響其神經系統、生殖系統等，給健康帶來了致命的威脅[5-8]。飼料安全就是食品安全，開展飼料原料中多環芳烴的檢測，摸清各種飼料原料多環芳烴污染狀況，有助于從源頭控制飼料質量安全，降低養殖畜禽產品、水產品中多環芳烴富集，最終保障人民群眾的身體健康。國內外有關飼料中多環芳烴檢測研究的公開報道甚少，Nácher Mestre Jaime等[9]報道了采用氣相色譜-高分辨質譜測定飼料和魚體組織中的多環芳烴含量，彭志通等[10]報道了GC-MS 法快速測定飼料用油脂中16 種多環芳烴。多環芳烴樣品前處理方法有超聲波萃取[11]、微波萃取[13]、加速溶劑萃取[13]、固相萃取[14]、凝膠滲透色譜[15]和QuEChERS法[16]等，測定方法有液相色譜法[17,18]、氣相色譜-質譜聯用法[19]、氣相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用法[20]、氣相色譜-三重四級桿-飛行時間質譜聯用法[21]和氣相色譜-高分辨質譜聯用法[9,22]等。本實驗采用超聲提取、凝膠滲透色譜凈化技術，研究建立氣相色譜質譜聯用法同時測定飼料原料中16種多環芳烴含量，旨在為飼料生產企業多環芳烴污染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，Free style全自動凝膠滲透色譜系統，KQ5200B型超聲波清洗器，Allegra 64R冷凍離心機，R-215旋轉蒸發儀，MTN-2800W氮氣濃縮儀。

玉米、DDGS、玉米蛋白粉、礱糠粉、小麥粉、豆粕、花生粕、雞肉粉、魚粉和豬肉粉等樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

稱取5 g(精確到0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入100 μL 2 μg/mL混合內標工作溶液，加入20 mL正己烷，高速漩渦混合1 min，超聲20 min，8 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至100 mL梨形瓶中；將殘渣用20 mL正己烷溶液重復提取兩次，離心后合并上清液于梨形甁中，于40 ℃水浴中旋轉濃縮至約1 mL，氮吹至近干，用乙酸乙酯+環己烷(50+50)溶液定容至10 mL，漩渦混合溶解，待凈化。

1.2.2 凈化

將凝膠滲透色譜儀調至最佳工作狀態，試樣由5 mL試樣環注入凝膠滲透色譜(GPC)柱，泵流速5.0 mL/min，用乙酸乙酯+環己烷(50+50)洗脫，棄去0～20 min餾分，收集20～55 min餾分，55～60 min沖洗GPC柱，將收集液于40 ℃水浴中旋轉蒸發濃縮至約1 mL，氮吹至近干，準確加入1 mL乙酸乙酯+環己烷(50+50)，漩渦混合1 min，過 0.22 μm微孔濾膜，待GC-MS測定。

1.2.3 氣相色譜質譜條件

色譜柱：HP-5 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫：初始溫度90 ℃，以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至270 ℃，再以3 ℃/min的速率升溫至310 ℃，保持2 min；進樣口溫度：260 ℃；色譜-質譜接口溫度：310 ℃；離子源溫度：230 ℃；載氣：氦氣，流速1.0 mL/min，純度≥99.999%；電離方式：EI；離子化能量：70 eV；測定方式：選擇離子監測方式；進樣量：1.0 μL；進樣方式：不分流進樣；溶劑延遲：3 min。

2 結果與討論

2.1 氣相色譜質譜條件的選擇和優化

參考文獻[10,11,13]，分別采用HP-5、HP-5 MS和HP-35毛細管柱進行GC-MS分析，HP-5和HP-35柱不能完全有效分離苯并(b)熒蒽和苯并(k)熒蒽、茚苯(1,2,3-c，d)芘和二苯并(a，h)蒽兩組化合物。實驗最終選擇HP-5MS毛細管柱，考察了三種程序升溫條件下16種多環芳烴和3種同位素內標的分離效果，升溫程序詳見表1～表3，3種升溫條件中，升溫程序3分離效果較好，時間較短，且升溫程序簡單，因此選擇升溫條件為升溫程序3，按照升溫程序3，16種多環芳烴和3種同位素內標的總離子流圖見圖1。

表1 程序升溫條件1

表2 程序升溫條件2

表3 程序升溫條件3

注：1 萘；2 苊烯；3 苊；4 芴；5 菲；6 蒽；7 熒蒽；8 芘；9 苯并(a)蒽；10 ；11 苯并(b)熒蒽；12 苯并(k)熒蒽；13 苯并(a)芘；14 茚苯(1,2,3-c，d)芘；15 二苯并(a，h)蒽；16 苯并(g，h，i)苝；內標1 D10-苊；內標2 D12-；內標3-D12-苯并(a)芘。圖1 16種多環芳烴和同位素內標總離子流圖(50 ng/mL)

按上述確定的氣相色譜條件對16種目標化合物和3種內標物進行全掃描分析，獲得全掃描質譜圖和每個組分的保留時間，考察各化合物的碎片離子和相對豐度，選擇豐度高的離子作為定量離子，豐度次高的2個離子為定性離子，再利用選擇掃描模式(SIM)，建立分類SIM掃描參數。16種目標化合物和3種內標物的保留時間及特征離子見表4。

表4 16種多環芳烴和同位素內標的保留時間及特征離子

2.2 提取方式的選擇

取5.00 g豬肉粉樣品于50 mL離心管中，加入相同量的多環芳烴標準溶液，加入20 mL正己烷后選擇超聲10 min、超聲20 min、超聲30 min和振蕩30 min提取等4種提取方式，測定其回收率，結果見圖2。結果表明，振蕩提取回收率低于超聲提取，超聲20 min回收率大于超聲10 min，超聲20 min和超聲30 min結果基本一致。因此，選擇超聲20 min作為飼料原料中多環芳烴測定的提取方式。

圖2 不同提取方式對加標回收率的影響(n=3)

2.3 凈化方法的選擇

實驗采用空白添加提取的溶液過固相萃取柱和凝膠滲透色譜儀(GPC)，比較MIP-PAHS SPE分子印記柱、氟羅里矽柱、中性氧化鋁柱、硅膠柱和凝膠滲透色譜儀(GPC)的加標回收率和凈化效果，回收率結果見圖3。結果表明，硅膠柱和凝膠滲透色譜儀(GPC)的回收率均可滿足實驗需求，但由于部分飼料原料粗脂肪質量分數較高，如魚粉高達12%、豬肉粉高達14%、膨化大豆高達16%，若不能有效脫除脂肪、色素等脂溶性物質，干擾會非常大，嚴重時影響定性和定量準確性。實驗結果表明，采用MIP-PAHS SPE分子印記柱、氟羅里矽柱、中性氧化鋁柱、硅膠柱等凈化魚粉、豬肉粉、膨化大豆等粗脂肪較高的樣品，凈化效果不理想、干擾較大，多環芳烴總離子流圖基線漂移較多，分離效果明顯低于凝膠滲透色譜(GPC)法，為降低干擾、保證分離度，確保目標化合物定量準確，最終選擇凝膠滲透色譜儀(GPC)作為飼料原料中多環芳烴測定的凈化方法。

圖3 不同凈化方法對加標回收率的影響(n=3)

表5 16種多環芳烴線性范圍、回歸方程、相關系數(r2)、檢出限及定量限

2.4 定量方式的選擇

圖4 外標法和同位素內標法對加標回收率的影響(n=3)

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

準確移取適量2 μg/mL多環芳烴標準儲備溶液和2 μg/mL混合內標工作溶液，用正己烷稀釋，16種多環芳烴系列標準溶液濃度為2、5、10、50、100、500和1 000 ng/mL，3種同位素內標物的濃度均為100 ng/mL，由低濃度到高濃度供氣相色譜質譜聯用儀測定。以標準溶液中被測組分的峰面積和內標峰面積的比值為縱坐標，以標準溶液中被測組分的濃度和內標濃度的比值為橫坐標繪制標準工作曲線。各目標化合物回歸方程及相關系數(r2)見表2。添加5 ng標準溶液于5.00 g空白玉米中，經提取后測定，依據信噪比S/N>3、S/N>10(按PtP算)計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，計算16種多環芳烴的檢出限，結果見表5。

從表5可知，16種目標化合物在線性范圍內線性良好，相關系數均大于0.999，各目標化合物的檢出限為0.6 ～1.2 μg/kg，定量限為1.8 ～3.6 μg/kg。該結果表明內標物濃度選擇適宜，可滿足線性范圍內目標化合物的測定，從圖1可看出該濃度下3種同位素內標物響應較高，分離不受其它化合物的影響，表明選擇的同位素內標物濃度滿足16種多環芳烴定量測定要求。

2.6 加標回收實驗

本方法采用標準添加法考察了16種多環芳烴在玉米、豆粕、魚粉、豬肉粉的添加回收實驗效果。在樣品中添加2、5、20 μg/kg等3個濃度梯度16種多環芳烴混合標準溶液，每個梯度進行6個平行實驗，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表6。結果表明，16種多環芳烴加標回收率在75.6%～94.8%之間，相對標準偏差在0.8%～11.9%之間。

表6 加標回收實驗結果(n=6)

2.7 實際樣品檢測

按照上述確定的條件和方法，分別測定DDGS、雞肉粉、花生粕、魚粉、礱糠粉、小麥粉、玉米蛋白粉和豬肉粉等實際樣品中16種多環芳烴含量，結果見表7。結果表明，所測定的8種飼料原料多環芳烴均有檢出，含量在ND～124 μg/kg之間。

表7 8種實際樣品檢測結果

3 結論

本研究建立了飼料原料中16種多環芳烴GC-MS定性定量測定方法，方法檢出限和定量限分別為0.6～1.2 μg/kg、1.8～3.6 μg/kg，該方法凈化效果好、靈敏度高、定性定量準確性高，可滿足飼料原料中 16種多環芳烴定量檢測需求。通過對玉米DDGS、雞肉粉、花生粕、魚粉、礱糠粉、小麥粉、玉米蛋白粉和豬肉粉等實際樣品檢測，結果表明當前使用的飼料原料均存在不同程度的多環芳烴污染，飼料生產企業、監管機構和主管部門有必要組織加強飼料原料中多環芳烴的檢測和監督，摸清各種飼料原料多環芳烴污染狀況，從源頭控制飼料質量安全，保障人民群眾的身體健康。