頂空氣相色譜法測定玉米粕中的六號溶劑殘留量

黃 建 武 佩 劉倩倩

(四川藍城檢測技術有限公司，成都 610000)

糧油加工企業使用植物油加工工藝主要有壓榨工藝和浸出工藝兩種。浸出工藝中，為了提高出油率，通常使用一種以正己烷為主(俗稱為“六號溶劑”)的液體作為浸提溶劑[1]。玉米粕是玉米胚油浸提工藝的主要副產物，該粕中通常殘留有一定量的六號溶劑。過高的溶劑殘留量，不僅影響粕類作為飼料的品質，也增加了溶劑損耗，提高了企業生產成本。因此，GB 14932—2016中規定食品加工用粕類中六號溶劑的殘留量應小于500 mg/kg。

GB 5009.262—2016規定了粕類中六號溶劑殘留量測定的基本方法，即稱取3 g樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，加入400 μL去離子水，密封，于60 ℃下平衡30 min后，采用頂空氣相色譜法分析。文獻報道和實際檢測均發現[2,3]，去離子水的加入量過低，粕類樣品無法均勻浸潤；且60 ℃加熱30 min的平衡條件下，粕類樣品受熱既不充分，也未均衡，待測溶劑從樣品中逸出不完全。這造成了該方法的測定數據不穩定、重復性差，實際應用存在困難。

本實驗采用高沸點有機溶劑(N，N-二甲基乙酰胺)在高溫條件(105 ℃)下充分浸提粕類樣品中的六號溶劑，并結合頂空氣相色譜分析技術，以正庚烷為內標物，對浸提液中的六號溶劑定量分析并與現有GB 5009.262—2016方法進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

玉米粕實驗樣品來源于某油脂生產企業。

1.1.2 試劑

N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、正庚烷等均為分析純，去離子水，六號溶劑標準品(10.0 mg/mL)。

1.1.3 儀器

氣相色譜儀；頂空進樣器；安瓿熔封機。

1.2 實驗方法

1.2.1 六號溶劑標準工作溶液的配制

準確吸取0.5 mL 10.0 mg/mL六號溶劑標準品至10 mL容量瓶，加入N，N-二甲基乙酰胺定容，得0.5 mg/mL六號溶劑標準工作溶液。

1.2.2 正庚烷標準工作溶液的配制

準確稱取分析純正庚烷200.0 mg至10 mL容量瓶，加入N，N-二甲基乙酰胺定容，得20.0 mg/mL正庚烷標準儲備溶液。吸取1.00 mL至10 mL容量瓶，加入N，N-二甲基乙酰胺定容，得2.0 mg/mL正庚烷標準工作溶液。

1.2.3 樣品前處理

準確稱取1.00 g樣品至15 mL安培瓶，準確加入10.00 mL 分析純N，N-二甲基乙酰胺，熔融密封。置烘箱中，于105 ℃下，熱浸提取3 h，冷卻至室溫，取1.00 mL至20 mL頂空瓶中，依次加入3.9 mL N，N-二甲基乙酰胺、100 μL正庚烷標準工作溶液，密封，待測。

1.2.4 儀器條件

頂空進樣器條件：平衡溫度為75 ℃；平衡時間為30 min。

氣相色譜條件：色譜柱：含5%苯基的甲基聚硅氧烷的毛細管柱(30 m×0.32 m m×0.25 μm)；載氣：高純N2；流速：1.7 mL/min，恒流模式；進樣口：230 ℃，分流比為20∶1；進樣量：1.0 mL；柱溫：45 ℃，恒溫15 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器(H2：30 mL/min，空氣：30 mL/min，尾吹N2：30 mL/min)。

2 結果與分析

2.1 色譜分離條件的優化

GB 5009.262—2016建議的升溫程序為：50 ℃保持3 min，1 ℃/min升溫至55 ℃保持3 min，30 ℃/min升溫至200 ℃保持3 min。色譜分析程序升溫過程需要20 min，且氣相色譜儀柱溫箱從200 ℃降溫至50 ℃平衡狀態，需要5 min，因此完成整個樣品分析的時間為25 min/次。為了不影響分離效果，且盡可能提高分析效率，實驗對升溫模式(恒溫、程序升溫)、色譜柱溫度、流速等影響分離效果的主要因素進行了考查。結果發現，待測組分沸點較低，且在非極性色譜柱上保留較小，出峰較快；同時，實際樣品中幾乎無高沸點雜質；其次，實驗采取的提取溶劑(N，N-二甲基乙酰胺)也能在15 min內流出。因此，針對該類樣品的分析，實驗優先選擇恒溫模式。在此基礎上，實驗進一步比較了色譜柱溫度(40、45、50 ℃)和色譜柱流速(1.5、1.7、2.0 mL/min)對分離效果的影響。結果發現，在40～50 ℃柱溫、1.5～1.7 mL/min柱流速范圍內，各組分間均能實現基線分離。且同等條件下，色譜柱溫度越低、流速越小，組分間分離度越大，但出峰時間也相對越晚，這和待測組分在色譜柱上的保留和流出速率有關系。綜合考慮，選擇45 ℃的柱溫和1.7 mL/min的柱流速作為分析條件，詳見1.2.4，在此條件下獲得的色譜圖見圖1。

注：化合物的出峰順序及保留時間，1為2-甲基戊烷(2.329 min)、2為3-甲基戊烷(2.410 min)、3為正己烷(2.513 min)、4為甲基環戊烷(2.754 min)、5為環己烷(3.108 min)、6為2，3-二甲基戊烷(3.253 min)、7為正庚烷(3.616 min)。圖1 六號溶劑的分離色譜圖

2.2 定量方法的選擇與確定

2.2.1 GB 5009.262—2016存在的問題

GB 5009.262—2016建議采用外標法進行粕類中六號溶劑殘留量的測定。因此，本實驗基于GB5009.262—2016提供的樣品制備方法和測試條件，取3.0 g粕類樣品于20 mL頂空進樣瓶中，加入400 μL去離子水，加入25 μL六號溶劑標準工作溶液，密封，頂空進樣分析。平行實驗8次，結果見表1。

表1 采用GB 5009.262—2016進行的實驗結果(n=8)

結果顯示，平行8次實驗結果相對標準偏差RSD%大于8%，重復性較差。究其原因，主要有2個因素導致了測試結果的相對不穩定：1)樣品制備過程中，400 μL去離子水無法完全浸潤3.0 g樣品，導致樣品浸潤不均勻；2)儀器分析過程中，樣品在60 ℃加熱30 min的平衡條件下，無法完全建立氣相與固相間的分配平衡。

2.2.2 提取溶劑的確定

為解決GB 5009.262—2016方法重復性差的問題，提高了頂空平衡溫度至75 ℃，延長平衡時間至45 min；且在3.0 g玉米粕的條件下，增大蒸餾水的體積至10 mL。結果發現，同一待測樣品的平行6次分析結果的RSD依然大于5%，較優化前略有好轉，這表明提高平衡溫度、延長平衡時間和增加提取液體積均可提高方法的重復性。但是，由于提取液體是和六號溶劑極性相反的水，進一步提高平衡溫度有一定困難(水的沸點為100 ℃)，延長平衡時間可能造成頂空瓶中氣體泄露，20 mL的頂空瓶最大加入液體體積為10 mL，因此實驗放棄了在水體系下繼續進行粕類殘留溶劑的方法開發。進而，考慮采用沸點更高、極性接近的有機溶劑，如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或二甲基亞砜等作為提取溶劑。經預實驗發現，3種有機溶劑的提取效果沒有明顯差異，綜合考慮溶劑中的雜質、溶劑沸點及出峰時間，實驗選擇了N，N-二甲基乙酰胺作為進一步實驗的溶劑。

2.2.3 進樣方式的選擇

殘留溶劑測定的主要進樣方法為液體直接進樣法和頂空進樣法。采用水作為提取溶劑時，水與六號溶劑互不相溶，頂空分析過程中，水扮演的角色更多的是富集待測組分；而六號溶劑在N，N-二甲基乙酰胺中有較好的溶解度，分析過程中，N，N-二甲基乙酰胺有富集、提取作用。因此，實驗嘗試溶劑提取、液體直接進樣的方式，進行六號溶劑殘留量的分析。結果發現高溫下，N，N-二甲基乙酰胺盡管能夠提取出玉米粕中的待測組分，但也不可避免地提取出一些未知干擾組分。為提高待測組分與干擾物之間的分離度，在30 m長色譜柱的基礎上，實驗考查了60 m長弱極性色譜柱的分離效果(見圖2)，實際分離圖顯示提取液中的干擾物質影響了待測組分的定量。因此，實驗最終采用頂空進樣方法。

注：化合物的出峰順序及保留時間，1為2-甲基戊烷(4.637 min)、2為3-甲基戊烷(4.829 min)、3為正己烷(5.055 min)、4為甲基環戊烷(5.662 min)、5為環己烷(6.536 min)、6為2，3-二甲基戊烷(6.794 min)、7為正庚烷(7.647 min)，a為六號溶劑標準品，b為玉米粕樣品。圖2 溶劑提取液直接進樣的色譜圖

2.2.4 樣品前處理方法的優化

實驗比較了高溫熱浸提取液 (過程見1.2.3)和液體直接浸泡頂空進樣(常規方法)2種前處理方法對于分析結果的影響。高溫熱浸提取過程由于在熔融密封的安培瓶中進行，能夠長時間(超過2 h)耐受105 ℃的高溫，該過程安全性高，且不擔心氣體泄漏。而液體直接浸泡過程由于在硅橡膠鋁扣壓蓋法密封的頂空瓶中進行，長時間加熱氣體容易泄露，溶劑在高溫加熱下存在一定的安全隱患，且短時間的加熱又無法保證固液提取平衡、氣液分配平衡，從而導致測試數據離散。通過2個不同樣品的測試結果發現，高溫熱浸提取液頂空進樣測試結果均高于液體浸泡法，且液體浸泡法的測試數據RSD大于10%，結果見表2。因此，最終確定采用高溫熱浸提取液頂空進樣的方法。

表2 高溫熱浸提取和液體直接浸泡兩種前處理方法的結果比較

2.2.5 內標法及內標物的選擇

為了消除六號溶劑組分在2種基質(純溶劑和提取液)中因氣液兩相分配差異而帶來的測試結果偏差，實驗采用內標法進行定量分析方法的研究。內標物通常優先選擇化學性質、色譜保留時間與待測組分相近的化合物。通過查閱文獻[4,5]和GB 5009.262—2016，正庚烷出峰時間緊靠在六號溶劑峰組后，且與N，N-二甲基乙酰胺分離度較大，是最理想的內標物。

2.3 方法學研究

在2.1和2.2基礎上，實驗進行了高溫熱浸提取液頂空進樣分析玉米粕中六號溶劑殘留量分析方法學的考查，考查的內容主要包括精密度、線性范圍、回收率、檢出限與定量限等指標。

2.3.1 精密度實驗

儀器精密度實驗：分別取1.2.1和1.2.2中六號溶劑標準工作溶液和正庚烷標準工作溶液適量，加入N，N-二甲基乙酰胺，補充體積至5.0 mL，密封，在1.2.4條件下進樣分析。平行6次分析結果為：六號溶劑峰面積總和(As)/內標物峰面積(Ai)比值的RSD為2.02%，表明儀器設備的精密度好，見表3。

表3 頂空氣相色譜法測定玉米粕中的六號溶劑殘留量的儀器精密度實驗

方法精密度實驗：分別平行6次稱取待測玉米粕樣品1.0 g，按照1.2.3所述方法處理，1.2.4中儀器條件測定。測試結果為：六號溶劑峰面積總和(As)/內標物峰面積(Ai)比值的RSD為2.29%，表明該分析方法的精密度好，見表4。

表4 頂空氣相色譜法測定玉米粕中的六號溶劑殘留量的方法精密度實驗

2.3.2 標準曲線

實驗依次吸取1.2.1中六號溶劑標準工作溶液0、50、100、200、300 μL至20 mL頂空瓶，加入1.2.2中正庚烷標準工作溶液100 μL后，N，N-二甲基乙酰胺補足至5.0 mL，密封，按照1.2.4儀器條件進樣分析。以六號溶劑峰面積總和(As)/內標物峰面積(Ai)比值為縱坐標，六號溶劑質量(Ms)/內標物質量(Mi)比值為橫坐標，線性回歸，擬合得到的曲線為：y=1.446 7x+0.015 8，相關系數r=0.999 9，y代表As/Ai，x代表Ms/Mi，在0～0.03 mg/mL范圍內線性關系良好。標準曲線的數據和擬合圖譜分別見表5和圖3。

表5 頂空氣相色譜法測定玉米粕中的六號溶劑殘留量的標準曲線

圖3 頂空氣相色譜法測定玉米粕中的六號溶劑殘留量的標準曲線圖

2.3.3 回收率實驗

為評價方法的準確度，實驗進行了3個添加水平的回收率實驗。樣品首先按照1.2.3和1.2.4測定本底；再按照250、500、1 000 mg/kg的六號溶劑添加水平，同法進行回收率實驗。結果表明，3個添加水平的回收率實驗結果在90%～100%之間，9個回收率數據之間的RSD為2.98%，測試結果可靠。結果見表6。

表6 頂空氣相色譜法測定玉米粕中的六號溶劑殘留量的回收率實驗

2.3.4 方法的檢出限和定量限

依據基線噪聲的10倍(10N)作為定量限，3倍(3N)作為檢出限的原則，以正己烷的峰高進行計算，該方法的檢出限為0.65 mg/kg，定量限為2.16 mg/kg。

2.4 實際樣品分析

在2.3的基礎上，實驗對10批玉米粕樣品進行了六號溶劑殘留量的測定，測試結果見表7。

表7 10批玉米粕樣品中六號溶劑殘留量的測定結果

3 結論

本研究參考GB 5009.262—2016粕類中六號溶劑殘留量的測定方法，從樣品前處理、色譜條件、定量方法等方面對該方法進行了優化和改進，獲得了一個具有良好精密度、重復性、準確度的分析方法。實驗所建立的方法精密度和重復性RSD%均小于2.5%，曲線線性相關系數r大于0.999 9，3個不同濃度水平的回收率均大于90%，回收率的RSD%小于3%。該方法不僅滿足國標對粕類殘留溶劑的檢測要求，并且操作方便、易于實現、數據準確，可為糧油加工企業提供參考。