機動車尾氣誘導大鼠血管內皮損傷模型

陳燕虹，方章福，蔡海榮，莊杰欽，趙子聰，郭永寧，金子淋，張浩波，趙 帥，陳伯鈞

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州醫科大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510120；3.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510006)

隨著工業革命、城鎮化進程加速和汽車交通工具的普行，空氣污染越來越嚴重。近年來，空氣污染對人體健康的影響越來越受到關注，研究表明，接觸細顆粒物空氣污染(空氣動力學直徑≤2.5 m，PM2.5)會增加冠心病等心血管疾病的風險。內皮損傷是冠心病等動脈粥樣硬化性心血管疾病的始動環節和病理基礎。有研究表明，內皮損傷在一定程度上和PM2.5暴露相關[1]。但是目前關于空氣污染誘發血管內皮功能損傷的模型較少。因此，本試驗通過觀察機車尾氣制造空氣污染對大鼠血脂、內皮功能、內皮舒張功能和主動脈病理變化，探討機動車尾氣誘導大鼠血管內皮損傷模型建立的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 健康雄性SPF級SD大鼠，20只，6～7周齡，體重160～180 g，購自廣東省醫學實驗動物中心[許可證號：SCXK(粵)2013-0002]，飼養于廣州醫科大學[許可證號：SYXK(粵)2015-0104]。大鼠一氧化氮(Nitric oxide，NO)試劑盒，購自北京百奧萊博科技有限公司(批號：SNM195-YQW)；內皮素(Endothelin-1,ET-1)試劑盒，購自南京金益柏生物科技有限公司(批號：JEB-13905);氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL) ELISA試劑盒，購自北京綠源伯德生物科技有限公司(批號：DG20862D)。全自動生化分析儀，購自日本東芝公司；YKY-800顯微鏡，購自上海永科光學儀器有限公司；TD5B離心機，購自江蘇省鹽城市凱特實驗儀器有限公司；RM6240B型多道生理生物信號采集器、JZJ01型張力換能器，購自四川成都儀器廠。

1.2 動物分組和模型建立 20只大鼠給予普通飼料適應性喂養1周后，隨機分為對照組和模型組，每組各10只，每只分籠喂養。對照組大鼠置于普通的SPF級動物房，呼吸新鮮空氣。模型組大鼠置于機車尾氣暴露房，關閉暴露房，打開開關，擰動摩托車引擎5 min，關閉開關，暴露6 h后搬出動物，置于普通SPF級動物房。暴露期間，摩托車尾氣的濃度為1 mg/m3,每周5 d，連續干預8周。造模期間所有大鼠均自由飲水和進食。

1.3 血脂及NO、ET-1水平測定 造模8周后，大鼠禁食不禁飲12 h，腹腔麻醉后經腹主動脈采血10 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，-80 ℃ 保存備用。全自動生化分析儀測定總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯 (Triglyceride cholesterol,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。硝酸還原酶法檢測NO水平。放免法檢測ET-1水平。ELISA法檢測ox-LDL水平。具體方法嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 組織H.E.染色病理學觀察 開胸取主動脈約2 cm，4%多聚甲醛固定24 h，經自來水沖洗，酒精行梯度脫水，用石蠟包埋,制成4 μm切片，用二甲苯脫蠟，再進行H.E.染色。染色后用光鏡定位于血管內膜觀察。

1.5 主動脈內皮功能測定 取一部分胸主動脈置于Krebs-Henseleit液中，剪成3 mm的血管環，連接多道生理生物信號采集器及張力換能器后，調整靜息張力2 g，再給予KCl預刺激2次，再給予去甲腎上腺素預收縮血管，穩定后給予濃度梯度的乙酰膽堿(Acetylcholine，Ach)(內皮依賴性血管舒張反應)和硝普鈉(Sodium nitroprusside，SNP)(內皮非依賴性血管舒張反應)誘導血管舒張反應，同步記錄血管張力的變化。

2 結果

2.1 各組大鼠血脂水平的比較 與對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL、ox-LDL明顯升高(P<0.05)，而HDL明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血脂水平的比較Table 1 Comparison of blood lipid levels in each group of rats

2.2 各組大鼠NO、ET-1的比較 與對照組比較，模型組大鼠血清NO明顯降低(P<0.05)，ET-1明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠血管內皮依賴性舒張功能比較 與對照組比較，模型組大鼠由Ach介導的內皮依賴性舒張程度明顯降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠NO、ET-1的比較Table 2 Comparison of NO and ET-1 levels in each group of rats

2.4 各組大鼠血管內皮非依賴性血管舒張功能比較 與對照組比較，模型組大鼠由SNP介導的內皮非依賴性舒張程度差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5 各組大鼠胸主動脈病理變化 對照組大鼠胸主動脈可見血管內膜無增厚，內皮細胞排列較整齊，大小較一致(中插彩版圖1A)；模型組大鼠胸主動脈血管內膜增厚，突向管腔，內皮細胞排列紊亂，可見較多嗜中性粒細胞(中插彩版圖1B)。

表3 各組大鼠血管內皮依賴性舒張功能比較Table 3 Comparison of the vascular endothelial-dependent diastolic function in each group of rats

表4 各組大鼠血管內皮非依賴性舒張功能比較Table 4 Comparison of the vascular endothelium-independent diastolic function in each group of rats

3 討論

隨著社會的進步和生活方式的改變，動脈粥樣硬化性心血管疾病發病率越來越高，并且呈現年輕化的趨勢。Zhao X等[2]研究發現，空氣污染同樣與心血管疾病密切相關，是動脈粥樣硬化性心血管疾病的重要致病因素。血管內皮功能損傷是冠心病等動脈粥樣硬化性心血管疾病的重要始動環節。血管內皮不僅是血液和血管之間的重要屏障,而且是代謝內分泌器官,可以釋放多種血管活性物質,包括NO、ET-1等,在調節血管張力等方面有重要作用[3-5]。內皮損傷指是指NO和ET-1失衡引起的內皮依賴性血管舒張功能受損[6-7]。NO可通過激活鈣-鈉離子通道活性、抑制血管平滑肌細胞增生和遷移、抑制內皮素等縮血管物質分泌、抑制粘附因子的表達及血小板的凝聚等途徑預防血栓形成。ET是目前已知的最強的收縮血管因子，在人VEC主要分布的是ET-1，有強大的縮血管作用[8-9]。因此NO分泌減少或活性降低或ET-1增加均可提示血管內皮損傷。

血管內皮損傷與脂質密切相關，血液中增加的LDL可損傷血管內膜，使內皮細胞特性發生改變，使單核細胞對血管內皮的粘附力增加，增加其粘附在內皮細胞的數量，通過趨化在內皮細胞間遷移，進入內膜后單核細胞轉化成巨噬細胞，巨噬細胞通過清道夫受體吞噬大量脂質，主要為內皮下大量沉積的ox-LDL。ox-LDL可以通過激活血管內皮細胞特異性受體,上調相關基因及蛋白表達,抑制NO和促進ET-1的生成,誘導血管舒縮功能障礙,促進內皮細胞表面粘附分子和細胞因子的生成來損傷內皮功能。ox-LDL還對內皮細胞有毒性作用，巨噬細胞在內膜下的積聚導致內膜進一步改變[10-11]。而乙酰膽堿引起的血管內皮依賴性舒張主要由一氧化氮，前列環素和內皮來源的超極化因子調節，其中NO是最主要的內皮依賴性舒張因子之一。

長期暴露于PM2.5環境中會導致內皮功能障礙，從而加速動脈粥樣硬化等心血管疾病的發展。近年來有研究結果顯示，PM2.5可能引起心血管內皮細胞損傷[12-13]。Naghavi M等[14-15]證實，PM2.5可以通過內皮功能受損等途徑影響血管的彈性和管徑的變化。趙金鐲等[16]觀察大氣PM2.5對大鼠心血管系統的急性作用,結果顯示,心電圖缺血改變,心臟自主節律功能降低,血壓和心肌酶學升高,且呈劑量-反應關系。因此，PM2.5可能通過內皮損傷進而導致心血管疾病的發生發展。但是目前關于空氣污染致內皮損傷的模型尚不成熟。本試驗通過機動車尾氣誘導空氣污染大鼠，結果發現，模型組大鼠TC、TG、LDL、ox-LDL、ET-1明顯升高，而NO、對Ach內皮依賴性舒張功能和HDL含量降低，胸主動脈內皮細胞排列紊亂。提示機車尾氣可引起內皮功能障礙，誘導大鼠內皮損傷模型。