1株豬源摩氏摩根菌的分離及鑒定

陳培培，齊 心，張 燦

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)又稱摩根菌，革蘭陰性短桿菌，屬于腸桿菌科摩氏摩根菌屬，廣泛存在于自然環境中，是一種條件致病菌，也是一種人獸共患病原菌[1]。摩根菌在動物體抵抗力下降或者在腸道定植為優勢菌群條件下，能夠引起人與動物的各種感染，如泌尿道感染、傷口感染、肺部感染等，食用污染摩氏摩根菌的肉制品與海產品等可導致食物中毒[2-3]。柯浩珍等[4]報道摩根菌引起病人陰囊感染；王磊等[5]報道摩根菌引起野生的黑格爾七彩神仙魚皮膚潰爛甚至死亡。作者從豬小腸內容物分離到1株疑似致病菌，通過培養特性、16S rDNA測序及同源性分析，確定其為摩氏摩根菌。通過動物回歸試驗檢測其致病性，同時進行藥敏試驗篩選其敏感藥物，旨在豐富該病原感染動物的種類，同時為防治摩根菌引起的感染提供用藥依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 營養瓊脂、S.S.瓊脂、麥康凱瓊脂、LB肉湯和革蘭染色液，均購自海博生物技術有限公司；19種藥敏紙片(新霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考、氨芐西林、左氧氟沙星、環丙沙星、頭孢曲松、鹽酸沙拉沙星、硫胺二甲嘧啶、單硫卡、多西環素、慶大霉素、諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、亞胺培南、美羅培南和氨曲南)，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR相關試劑，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗動物 4周齡昆明系小鼠18只，購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離與純化 無菌條件下取豬小腸內容物，分別劃線接種于營養瓊脂平板、S.S.瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養24 h，再挑取菌落形態特征明顯的單菌落，劃線傳代培養，純化4代以上，革蘭染色后鏡檢。

1.3.2 16S rDNA 擴增和測序 以菌液為模板，根據廖中華等[6]報道的通用引物進行16S rDNA的PCR。引物序列為：16S-F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；16S-R：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，預期擴增的目的片段大小為1 406 bp。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.3 同源性分析 將16S rDNA測序結果提交到GenBank中進行序列同源性比對，選擇同源性較高的13條序列，通過MEGA 7.0 軟件用Neighbor-Joining方法(默認參數)繪制進化樹，并進行同源性分析。

1.3.4 動物回歸試驗 將分離純化的細菌接種到LB液體培養基，37 ℃震蕩培養24 h至菌液濃度為1.0×1010CFU/mL。18只昆明系小鼠隨機分為3組：空白組、腹腔注射組和灌胃組，每組6只。空白組每只腹腔注射LB肉湯0.5 mL，腹腔注射組每只小鼠注射菌液0.5 mL，灌胃組每只小鼠灌胃菌液0.5 mL，觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，記錄結果。

1.3.5 藥敏試驗 參照徐強等[7]所用的紙片擴散法對19種藥物進行敏感性檢測。用棉簽將菌液均勻涂布于營養瓊脂平板，待培養基完全吸收菌液后，將各藥敏紙片貼于培養基表面適當的位置，37 ℃ 培養24 h，測量抑菌圈直徑(mm)，參照EUCAST歐盟藥敏試驗(2016年)[8]介紹的標準進行結果判定。

2 結果

2.1 細菌的分離及形態學特征 分離菌株在營養瓊脂平板上生長狀況良好，37 ℃培養24 h后，形成圓潤、光滑、邊緣整齊、不透明的乳白色菌落。在S.S.瓊脂平板上形成透明的小菌落，在麥康凱瓊脂平板上形成圓潤、不透明的粉紅色菌落。染色鏡檢結果為粉紅色、單個或成對排列，兩端鈍圓的短桿菌，因此判定為革蘭陰性桿菌(見中插彩版圖1)。

2.2 藥敏試驗 以19種常規抗生素對分離菌株進行藥物敏感性試驗，結果見表1。由表1可知，分離菌株對頭孢噻肟、左氧氟沙星、環丙沙星、氟苯尼考、鹽酸沙拉沙星、鏈霉素、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南和氨曲南10種抗生素表現為敏感，氨芐西林、頭孢曲松、新霉素、單硫卡4種抗生素表現為中度敏感，恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、多西環素和諾氟沙星5種抗生素表現為耐受。

表1 分離菌株藥敏試驗Table 1 Drug sensitivity test of isolated strain

2.3 16S rDNA 的PCR 擴增 以菌液為模板，進行16S rDNA 的PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2。由圖2可知，擴增得到與預期片段大小一致的目的片段，大小為1 406 bp。

圖2 分離菌株的16S rDNA 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 16S rDNA agarose gel electrophoresis results of isolated strainsM:DL-2 000 Marker;1～2:分離菌株;3.陰性對照M:DL-2 000 Marker;1～2:Isolated strain;3:Negative control

2.4 同源性分析 16S rDNA測序結果在GenBank中進行同源性比對，結果表明，該菌株為摩根菌，菌株序列提交到GenBank，登錄號為MK361125。用Neighbor-Joining方法對該序列及其同源性較高的其他13條序列進行同源性分析，繪制進化樹，結果見圖3。由圖3可知，分離菌株QX01與其余菌株有很高的同源性，均在97%以上。這些菌株分別來源于印度、中國、日本、比利時、加拿大和尼日利亞，說明摩根菌在自然界中廣泛分布。

2.5 動物回歸試驗 分離菌株分別通過腹腔注射和灌胃途徑接種昆明系小鼠，檢測其致病性。回歸試驗結果顯示，空白組小鼠正常，未出現發病和死亡；腹腔注射組在注射10 h后全部死亡；灌胃組在1周內全部死亡。剖檢發現,腹腔注射組和灌胃組死亡小鼠肝臟和肺臟有不同程度地充血、出血現象(見中插彩版圖4)，病變的肝臟及肺臟在營養瓊脂平板、S.S.瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上進行劃線培養，分離到相同形態的菌落。

圖3 同源性分析Fig.3 Homology analysis▲：本試驗所分離菌株▲：Strain isolated in this test

3 討論

摩根菌是一種人獸共患病原菌，致病性強且感染范圍廣泛，能夠引起人和動物的肺炎、尿道炎、關節炎等病癥[9-10]。據報道多種水產動物對摩根菌均易感。楊移斌等[11]從患病烏鱧肝、腎、脾及潰爛皮膚肌肉等組織器官分離到摩根菌；韋陽道等[12]從患病胡子鯰脾臟中分離到強致病性的摩根菌。同時，摩根菌也是重要的醫院內條件致病菌。譚家余等[13]報道了泌尿系統感染摩根菌，可導致感染性休克和多功能器官損傷；朱永琪等[9]報道摩根菌引起1名順產后產婦重癥感染的病例。家畜感染摩根菌發病病例報告較少。本實驗室從豬的小腸內容物中分離到菌株，經16S rDNA測序及同源性分析鑒定為摩根菌。據筆者所知，這是國內首次分離到的豬源摩根菌。該菌以不同的途徑感染昆明系小鼠，通過腹腔注射和消化道途徑均能導致小鼠內臟器官不同程度的出血腫脹等病變，說明分離株QX01具有較強致病性。廖中華等[6]從山羊中分離到的摩根菌腹腔注射途徑能引起感染，但是消化道途徑不能引起感染，說明不同的摩根菌菌株致病性存在差異。目前該菌的感染機制和致病機理尚不明確，需要進一步研究。

本試驗對該菌進行了19種藥物的敏感性檢測。已有報道表明，摩根菌對多種常用抗生素具有耐受性。李雪峰等[14]報道該菌對氨芐西林、氟苯尼考和復方新諾明等耐受；蘭云等[15]報道利福平、呋喃妥因和頭孢噻吩等耐受。本試驗中分離到的摩根菌QX01對頭孢噻肟等14種藥物敏感或中度敏感，對恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、多西環素和諾氟沙星5種藥物耐受，這與之前報道存在差異，說明不同地區分離到的摩根菌菌株對藥物的敏感性各不相同，受當地抗生素使用情況影響，提示養殖戶在養殖過程中要慎重、合理用藥。

本次試驗首次從豬的小腸內容物中分離到具有致病性的摩根菌，當豬只抵抗力下降時，可能引起豬只感染，造成經濟損失，其潛在危害應引起養殖戶的重視。