4種獸用狂犬病活疫苗的免疫效果評價

侯 巍，魯志平，陳 斌，陽愛國，莫 茜，周明忠，尹 杰，袁東波，毛光瓊，伊力軍，郭 莉，楊治聰

(1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都農業科技職業學院，四川 成都 611130;3.四川省眉山市動物疫病預防控制中心，四川 眉山 620020)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患的中樞神經系統急性傳染病，目前對于該病尚缺乏有效的治療手段，人患狂犬病后的病死率幾近100%[1]。狂犬病病毒宿主范圍廣泛，犬為該病毒的主要宿主[2]。21世紀初，我國狂犬病病人逐年增加，發病數呈現逐年上升趨勢[3]，直到2008年開始我國狂犬病人數逐年下降，這可能是政府部門加大了預防控制力度[4]，從而狂犬病的發病率降低。在我國，狂犬病病人中有94%是由家犬引起的[5]。對犬只接種獸用狂犬病疫苗是預防人狂犬病最好的辦法[6]。為了探索有效的預防和控制狂犬病發生的重要措施，本試驗對近年來四川省常用的4種獸用狂犬病(Flury株)活疫苗進行了免疫效果檢測，對前期犬只狂犬病疫情防控情況更好的進行評價，為后期犬只狂犬病滅活苗的使用提供綜合借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗犬 3月齡以上，年齡相當，未免疫過狂犬病疫苗或經檢測無狂犬病病毒抗體，未孕的健康犬只150只，雌雄各半，品種均為土雜犬只。四川省閬中市、蓬溪縣各75只，分為10組，每組15只。

1.2 疫苗 (1)A獸用狂犬病活疫苗，批號為151206；(2)B獸用狂犬病活疫苗，批號為1603002；(3)C獸用狂犬病活疫苗，批號為2016008；(4)D獸用狂犬病活疫苗，批號為1605007。4種疫苗分別由齊魯動物保健品有限公司、吉林正業生物制品股份有限公司、中牧實業股份有限公司、瑞普(保定)生物藥業有限公司生產。

1.3 抗狂犬病抗體 ELISA 檢測試劑盒 由北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產，96頭份/盒，批號為20170304。

1.4 方法

1.4.1 試驗犬分組 閬中市犬只分為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組，蓬溪縣犬只分為Ⅵ組、Ⅶ組、Ⅷ組、Ⅸ組、Ⅹ組，其中Ⅰ組、Ⅵ組免疫A疫苗，Ⅱ組、Ⅶ組免疫B疫苗，Ⅲ組、Ⅷ組免疫C疫苗，Ⅳ組、Ⅸ組免疫D疫苗，Ⅴ組、Ⅹ組為空白對照組。

1.4.2 免疫次數及劑量 各免疫組頸部肌肉注射，1頭份/只，首免后1個月加強免疫1次。空白對照組不免疫。

1.4.3 免疫副反應 分別在首免、二免后對疫苗免疫組及空白對照組犬只的免疫副反應等進行記錄。

1.4.4 中和抗體檢測 于首免后1個月、二免后3個月、二免后10個月，分別采集試驗犬只血液，分離血清，應用抗狂犬病抗體 ELISA 檢測試劑盒檢測血清中IgG 抗體。操作步驟：試劑盒放置室溫平衡30 min；備檢犬血清1∶10稀釋；加入稀釋好的樣品，每孔100 μL。陰性、陽性對照各加1孔，臨界對照加2～3孔，空白對照加1孔；置37 ℃溫箱中孵育30 min；反復洗板3次；加酶標記物50 μL，置37 ℃溫箱中孵育30 min；洗板3次，滴加顯色液A、B各50 μL。置37 ℃避光顯色10 min；每孔加終止液50 μL，混勻后以空白孔調零，用酶標儀450 nm波長測定A值。陰性對照值應≤0.10，臨界對照 A 值應在 0.15～0.40，試驗成立。如樣品孔 A 值≥臨界對照 A 值的平均值判為陽性，達到抗體保護水平；反之為陰性。世界衛生組織(WHO)規定犬只抗狂犬病抗體群體陽性率高于70%為合格，可以抵御狂犬病野毒的感染。

2 結果

2.1 免疫副反應 4種疫苗在首免和加強免疫后，4組犬只均有不同程度的免疫副反應，對照組無任何免疫副反應。其中疫苗A組30只試驗犬中，有4只犬同時出現體溫略微升高、精神沉郁、不愿走動、采食量下降等免疫副反應癥狀，免疫后第5天癥狀消失；疫苗B組30只試驗犬中，有2只犬出現體溫略微升高，4只犬出現精神沉郁、采食量下降等免疫副反應癥狀，免疫后第6天癥狀消失；疫苗C組30只試驗犬中，有2只犬出現體溫升高、進食異常，4只犬精神沉郁等免疫副反應癥狀，免疫后第3天癥狀消失；疫苗D組30只試驗犬中，有4只犬出現體溫升高、精神沉郁，2只犬進食異常等免疫副反應癥狀，免疫后第4天癥狀消失，見表1。同時對閬中市、蓬溪縣兩地試驗犬只，按照不同免疫疫苗組分別進行免疫副反應統計，不同疫苗組免疫副反應在區域間比較無顯著差異(P>0.05)，如圖1。試驗過程中未出現因疫苗免疫副反應造成的犬只死亡情況。

表1 不同疫苗在首免、二免后未出現免疫副反應情況統計Table 1 Side effects statistic of four vaccines post first and second immunization (只)

圖1 不同地區免疫副反應比較Fig.1 Immunological side effects comparison of different zones

2.2 中和抗體檢測

2.2.1 首免前免疫抗體檢測 首免前應用ELISA 檢測法分別對閬中市、蓬溪縣的150只犬只進行狂犬病抗體檢測，全部為抗體陰性，符合所需試驗動物要求。

2.2.2 中和抗體比較 各檢測期檢測結果，臨界對照A值的平均值在0.25～0.27。各組不同檢測時期抗體水平合格犬只數量見表2。首免后1個月(即加強免疫前)分別對所有疫苗免疫組、空白對照組試驗犬只進行采血，檢測狂犬病疫苗中和抗體，閬中市、蓬溪縣疫苗組犬只免疫抗體群體陽性率比較差異不顯著(P>0.05)；二免后3個月，兩地犬只群體陽性率比較差異不顯著(P>0.05)；二免后10個月二者差異不顯著(P>0.05)；分別與首免前比較差異顯著(P<0.05)。見表2。

表2 不同區域間試驗犬組中和抗體陽性率的比較Table 2 Neutralizing antibody positive rate comparison of test dogs group in different zones (只)

2.2.3 免疫抗體組間比較 疫苗試驗組犬只免疫抗體在首免前與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)；在免疫后各檢測期，疫苗A犬只群體陽性率相比其他3種疫苗相比差異顯著(P<0.05)，同種疫苗各檢測期比較差異顯著(P<0.05)，同種疫苗不同組間比較，差異不顯著(P>0.05)，見表3。

表3 同種疫苗中和抗體組間比較Table 3 Neutralizing antibody comparison between 4 groups (只)

2.2.4 免疫抗體消長情況 根據4個不同疫苗組首免前、首免后1個月、二免后3個月、二免后10個月試驗犬只血清狂犬病免疫抗體群體陽性率，見表4，A、B、C、D四種疫苗免疫犬只后均能在首免后1個月達到有效保護水平，二免后3個月4種疫苗組犬只抗體群體陽性率均處于上升水平，與首免后1個月分別比較，差異顯著(P<0.05)；二免后10個月疫苗A、B、C組犬只群體陽性率仍然處于有效保護水平，說明首免1個月后加強免疫，免疫保護水平至少達10個月，D組犬只達不到10個月。同時，根據本次試驗檢測數據，從中篩選出最適疫苗A。

3 討論

試驗所采用的4種疫苗免疫犬只后，均對少量犬只有不同程度的免疫副反應，出現的免疫副反應癥狀以出現短暫的體溫略微升高、精神沉郁、不愿走動、采食量下降為主要免疫副反應癥狀，上述反應均在1周以內逐步恢復正常，試驗過程中未出現因疫苗免疫副反應造成的犬只死亡情況，說明4種疫苗在臨床應用過程中均較為安全。

試驗的4種疫苗毒株均為Flury株，Flury株是由美國科學家于1939年分離的狂犬病病毒Flury株經雞胚和細胞傳代演變而來的弱毒疫苗株[7]，由此制備的犬用狂犬病疫苗效果確切，但不同生產廠家在疫苗制備工藝及質控等方面存在差異，導致不同廠家生產的疫苗間在實際應用中效果不同。

采集犬只血清樣品受各種因素影響，未開展加強免疫后更多頻次的采樣檢測工作，免疫后各時期的檢測數據尚欠缺，只開展了首免1個月、二免后3個月、二免后10個月的檢測，無法進行更加詳細的數據分析，從幾次的抗體檢測情況來看，各疫苗二免后3個月犬只免疫抗體群體陽性率接近峰值水平，后逐步回落，但二免后10個月疫苗A、B、C組群體合格率仍然處于有效保護水平，高于WHO規定犬只免疫抗體群體陽性率70%的標準，同時，抗體陽性犬只A值均在2～2.5，明顯高于臨界值A平均值0.26。

表4 不同疫苗中和抗體組間比較Table 4 Neutralizing antibody comparison of 4 groups (只)

試驗過程中，閬中、蓬溪兩地犬只未進行犬只年齡、品種、性別等方面的分類，但從本次試驗結果來看，疫苗安全性和免疫效果與試驗犬只的年齡、品種及性別等方面不存在明顯的聯系，也說明犬只的年齡、品種、性別對本次試驗結果未造成明顯影響。

根據歷史檢測數據，每年單次免疫，有效保護期為3個月左右，從本次試驗對近年來全省犬只按照一年2次頸部肌肉注射、1頭份/只、間隔期1個月的免疫效果評價來看，表明加強免疫對于提高犬只抗狂犬病抗體水平及群體陽性率起到切實效果，表明四川省針對犬只狂犬病近年來采用的免疫方法是行之有效的，也為后期采用狂犬病滅活疫苗的推廣使用提供參考。