6種中藥醇和水提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效果評價

王悅尚，趙亞楠，翟云逸，張庭華，姜勝男，楊 燕，王 慧

(1.臨沂大學藥學院，山東 臨沂 276000；2.華中農業大學動科動醫學院，湖北 武漢 430070；3.臨沂大學農林科學學院，山東 臨沂 276000；4.臨沂市農業科學院，山東 臨沂 276012)

目前，由于抗生素濫用帶來的細菌耐藥性、環境污染以及動物源性食品安全問題日趨嚴重[1-2]，如何尋找安全、高效、綠色、無污染的抗生素替代品是廣大獸醫工作者亟待解決的問題。天然中草藥因具有毒性低、抗菌范圍廣、不易產生耐藥性、價格低廉等優點而成為研究的焦點[3]。本試驗以天然中草藥甘草、黃連、板藍根、黃芩、黃芪、大青葉等為研究對象，研究其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效果，為尋找獸醫臨床中細菌性感染天然治療藥物提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 WK-800A高速藥物粉碎機(青州市精誠機械有限公司)；RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SHK-Ⅲ循環水式多用真空(鄭州科泰實驗設備有限公司)；優譜超純水機(四川優普超純科技有限公司)；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；SHP-160生化培養箱(金壇市盛藍儀器制造有限公司)；SW-CJ-1D單人單面超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

1.2 藥物 板藍根、黃連、黃芩、黃芪、甘草、大青葉(臨沂康宇中藥飲片有限公司)。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(中國獸醫藥品監察所)。

1.4 方法

1.4.1 中藥水提取物的制備 各藥材經粉碎機粉碎后，取粗粉30 g，置于1 000 mL圓底燒瓶，并加入600 mL蒸餾水浸泡2 h，煮沸回流2 h，趁熱用紗布過濾，得一次提取液；圓底燒瓶加入600 mL蒸餾水煮沸回流2 h，趁熱用紗布過濾，得二次提取液；將2次提取液合并，用旋轉蒸發儀(80 ℃、160 r/min)，濃縮提取液達原體積1%時，將濃縮液倒至培養皿中置于電熱恒溫鼓風干燥箱恒溫干燥(溫度70 ℃)，3 d 后可得中藥水提取物的干燥物。

1.4.2 中藥醇提取物的制備 方法同2.1，區別在于本提取方法以乙醇作為溶劑，提取各藥材的醇提物，并制備母液。

1.4.3 中藥提取物工作液配制 稱取中藥水提取或醇提物干燥粉末0.4 g加入10 mL離心管，加蒸餾水配制濃度為40 mg/mL母液，超聲溶解，并經0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌，密封，放4 ℃冰箱備用，于試驗開始前將母液稀釋至所需濃度。

1.4.4 細菌活化及菌落計數 取滅菌試管，加入肉湯培養基，用接種環鉤取大腸桿菌放入肉湯培養基，放生化培養箱(37 ℃)培養16～24 h。選取活化的大腸桿菌菌懸液，采用試管10倍濃度遞減稀釋法稀釋菌懸液，依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。從10-3～10-8對應濃度的試管中各取100 μL分別涂布營養瓊脂培養基上，放入生化培養箱37 ℃培養16～24 h，計算菌落個數。根據稀釋濃度推算菌懸液的活菌數[4]。金黃色葡萄球菌活化及菌落計數方法同大腸桿菌。

1.4.5 藥敏試驗 將18～20 mL營養瓊脂培養基倒入已滅菌培養皿中，水平靜置，凝固后在平板底部平均分成3個區域(5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL)，分別標記5、10、20，平皿外部標記菌種、提取方式、藥物名稱。取107CFU /mL的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌100 μL 涂布到平板上，3個區域中心各放1個牛津杯，將各對應濃度的無菌藥液200 μL加入牛津杯中，放生化培養箱37 ℃培養18～24 h，觀察藥物對金黃色葡萄球菌或大腸桿菌有無抑菌圈，并用游標卡尺量取抑菌圈直徑(mm)。

根據抑菌圈直徑，確定藥物對細菌的敏感程度，判定標準見表1。

表1 藥物敏感試驗判定標準Table 1 Determination criteria of drug sensitivity test

1.4.6 最低抑菌濃度(MIC)試驗[5]取11支試管，每管加1 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養基，第1支試管加入1 mL 20 mg/mL的藥液，采用試管2倍稀釋法稀釋至第9支試管，試管中藥物濃度依次為10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04 mg/mL。1～10支試管各加入100 μL的105CFU/mL菌液，第11支試管加入100 μL無菌生理鹽水，前9支試管作為試驗管，第10支試管為細菌對照，第11支試管為陰性對照。放生化培養箱37 ℃培養16～24 h，觀察細菌生長情況，以無細菌生長的藥物最低稀釋濃度為該藥物的最小抑菌濃度(MIC)。

1.4.7 最低殺菌濃度(MBC)試驗[5]根據藥物醇和水提取物的MIC，將未見細菌生長的各試驗試管搖勻后分別吸取100 μL加入到營養瓊脂培養基上，涂布均勻，放入生化培養箱37 ℃培養16～24 h后用活菌計數法檢查平皿上的菌落，菌落數小于5個的視為無細菌生長，以無細菌生長的最低濃度作為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結果

2.1 不同中藥提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的藥敏試驗

2.1.1 中藥水提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的藥敏試驗 試驗結果表明，大青葉、板藍根、甘草、黃連、黃芪、黃芩水提物對大腸桿菌無抑菌作用，對金黃色葡萄球菌，僅黃連水提物表現較強的抑菌作用，并且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果增強，濃度在5～20 mg/mL時對金黃色葡萄球菌均表現極敏，結果見表2。為探明黃連水提物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌效果，故又進行了0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL黃連水提物對金黃色葡萄球菌的藥敏試驗，結果表明，0.5～2 mg/mL黃連水提物對金黃色葡萄球菌也表現極敏，結果見表3。

表2 不同中藥水提物對檢測菌的抑菌圈直徑Table 2 The inhibition zone diameters of different Chinese medicine water extracts on the detected bacteria

表3 黃連水提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的藥敏試驗Table 3 Sensitivity test of water extracts of Rhizoma coptidis to E.coli and S.aureus

2.1.2 中藥醇提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的藥敏試驗 大青葉、板藍根、甘草、黃連、黃芪、黃芩醇提物對大腸桿菌無抑菌作用，對金黃色葡萄球菌，僅黃連醇提物表現較好的抑菌效果，并且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果逐漸增強。黃連醇提物濃度在5～20 mg/mL時對金黃色葡萄球菌均表現極敏，結果見表4。為探明黃連對金黃色葡萄球菌的最佳抑菌濃度范圍，故又進行了0.5 mg/mL、1 mg/mL 和2 mg/mL 黃連醇提物對金黃色葡萄球菌的藥敏試驗，發現0.5～2 mg/mL黃連醇提物對金黃色葡萄球菌表現高敏，見表5。

表4 不同中藥醇提物對檢測菌的抑菌圈直徑Table 4 The inhibition zone diameters of different Chinese medicine alcohol extracts on the detected bacteria

表5 黃連醇提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的藥敏試驗Table 5 Sensitivity test of alcohol extracts of Rhizoma coptidis to E.coli and S.aureus

2.2 黃連醇和水提取物對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度 黃連水提物對金黃色葡萄球菌MIC結果表明，藥物管1～9支試管均未出現渾濁，為確定黃連水提物對金黃色葡萄球菌的MIC，故對藥物進行了2次稀釋，結果發現，黃連水提物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.04 mg/mL。黃連醇提物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.08 mg/mL。結果見表6。

表6 黃連醇水提取物對金黃色葡萄球菌MICTable 6 Determination of the minimal inhibitory concentration(MIC) of Rhizoma coptidis alcohol and water extracts on Staphylococcus aureus

2.3 黃連醇和水提取物對金黃色葡萄球菌最低殺菌濃度 黃連水提物第9個平板長有金黃色葡萄球菌，而第8個平板沒有菌落。由此得出黃連水提取物對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度(MBC)為0.08 mg/mL。而黃連醇提取物第8個平板長有金黃色葡萄球菌，而第7個平板沒有菌落，由此得出黃連醇提取對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度(MBC)為0.16 mg/mL。

3 討論

6種中藥醇和水提取物中僅黃連醇提物和水提物對金黃色葡萄球菌表現較強的抑菌效果，濃度在0.5 mg/mL時，黃連醇提物和水提物對金黃色葡萄球菌分別達高敏和極敏。黃連醇提物和水提物對金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.08 mg/mL和0.04 mg/mL，MBC結果顯示，黃連醇和水提取物對金黃色葡萄球菌均表現殺菌作用，MBC分別為0.16 mg/mL和0.08 mg/mL。本次試驗表明，黃連醇水提物對金黃色葡萄球菌抗菌活性明顯，且其水提物抑菌效果優于醇提物，這可能與不同提取方式獲得有效成分的不同有關[6]。

盧肖英等[6]研究表明，黃連不同炮制方法，對金黃色葡萄球菌的抗菌效果不同，其中生黃連對金黃色葡萄球菌的抗菌效果最好，MIC為0.6 mg/mL。李俊超[7]等發現，黃連水提物對Sa5金黃色葡萄球菌株抑菌效果最好，MIC為0.008 g/mL；而黃連醇提物Sa4、Sa5金黃色葡萄球株抑菌效果最好，MIC為0.008 g/mL。王瑞君等[8]也研究了黃連水提物對金黃色葡萄球菌的抗菌效果。綜合目前針對黃連提取物對金黃色葡萄球的抗菌效果評價，本試驗獲得的黃連醇和水提物，對金黃色葡萄球的最低抑菌濃度均優于前人相關研究，這可能與藥材來源與產地、提取工藝等因素有關。此外，張穎穎等[9]研究表明，黃連提取物與黃芩以2∶1比例混勻后，對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌效果更好。這表明，黃連與其他中藥配伍，可能獲得更好的抑菌效果。通過從傳統中藥組方中尋找黃連相關方劑，篩選組方中各有效成分，進行配伍及抑菌試驗，獲得對金黃色葡萄球菌效果最優的中藥組合物，可能是我們下一步需要探究的問題。

黃連中含有的生物堿(如小檗堿、黃連堿、巴馬亭、表小檗堿)抗菌活性較強[10-12]。其中異喹啉類生物堿小檗堿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌具有顯著抗菌活性，其發揮抗菌作用的機制與干擾細菌蛋白質的合成有關[13-14]。通過本次試驗表明，黃連醇和水提取物對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌作用，且其水提物抑菌效果優于醇提物。下一步還需明確黃連提取物中哪些成分發揮了抗菌作用，其作用機制如何，是否對其他微生物也有抗菌作用等問題。