黃連解毒湯對膿毒癥急性肺損傷大鼠炎癥因子和氧化應(yīng)激的影響

劉淑玲，蔡海榮，，陳燕虹，莊杰欽，蔡鑫桂，張為章，張烈元，陳伯鈞

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405)

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，SPF級，30只，體質(zhì)量(190±10) g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[許可證號：SCXK(粵)2013-0002]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～28 ℃、相對濕度40%～70%，光照12 h，明暗交替。

1.2 藥品、試劑和儀器 黃連解毒湯(黃連15 g，黃芩15 g，黃柏15 g，梔子15 g)，由廣東省中醫(yī)院藥劑科提供。分別加6倍和4倍量的水煎煮2次，每次60 min，2次藥液混合后置于100 ℃環(huán)境濃縮至原藥材含量為1 g/mL。TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；MDA、SOD、XO、GSH-Px ELISA試劑盒，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MS-TS電子分析天平，購自梅特勒-托利多國際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和模型構(gòu)建 所有大鼠給予標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組、模型組和黃連解毒湯組，每組各10只。采取盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and perforation，CLP)建立膿毒癥急性肺損傷模型[5]：模型組和黃連解毒組大鼠用10%水合氯醛3 mL/(kg·bw)經(jīng)腹腔注射麻醉后，仰臥于手術(shù)臺上，固定四肢，腹部備皮，常規(guī)消毒，沿腹正中線做2～3 cm的手術(shù)切口，逐層剖開腹部，尋找盲腸，在盲腸末端1.5 cm處結(jié)扎，然后用注射針頭在盲腸遠端扎穿2次形成盲腸漏，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁。假手術(shù)組大鼠切開腹部尋找盲腸后，不結(jié)扎，不穿刺，直接還納腹腔。造模時間為24 h，造模過程中，假手術(shù)組大鼠全部存活，模型組和黃連解毒湯組各死亡1只。

1.3.2 給藥方法 大鼠給藥劑量按人與大鼠之間體表面積折算[6]等效劑量為4 g/(kg·bw·d)。造模24 h后，黃連解毒湯組給予用黃連解毒湯4 g/(kg·bw·d) 灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水4 mL/(kg·bw·d)灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃3 d。給藥期間假手術(shù)組大鼠全部存活，模型組死亡2只，黃連解毒湯組死亡1只。

1.3.3 動脈血氣檢測 末次給藥后所有大鼠禁食不禁飲12 h，用10%水合氯醛3 mL/(kg·bw)腹腔注射麻醉，打開腹腔，無菌肝素化注射器從腹主動脈取血10 mL行動脈血氣分析。

1.3.4 ELISA法檢測肺組織TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB、XO、GSH-Px、MDA、SOD 打開大鼠胸腔，取出雙肺組織，右肺用生理鹽水清洗干凈后，勻漿機勻漿，15 000 r/min離心，取上清液，ELISA測定TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB、XO、GSH-Px、MDA、SOD。

1.3.5 肺組織濕/干重比(W/D)測定 取出左肺，用濾紙吸干左肺多余水分后稱重(濕質(zhì)量)，然后置于80 ℃烤箱內(nèi)烘烤72 h，再次稱重(干質(zhì)量)，計算肺濕/干重比(W/D)。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB檢測 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃連解毒湯組大鼠肺組織TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠動脈血氣檢測結(jié)果Table 1 Levels of arterial blood gas test of rats in each group

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB檢測結(jié)果Table 2 Levels of TNF-α,IL-1,IL-6 and NF-κB in lung tissue of rats in each group

2.3 各組大鼠肺組織XO、GSH-Px、MDA、SOD檢測結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織GSH-Px、SOD水平明顯降低(P<0.05)，XO、MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃連解毒湯組大鼠肺組織GSH-Px、SOD水平明顯升高(P<0.05)，XO、MDA水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肺組織XO、GSH-Px、MDA、SOD檢測結(jié)果Table 3 Levels of XO,GSH-Px,MDA and SOD in lung tissue of rats in each group

2.4 各組大鼠肺組織W/D比 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織W/D比明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃連解毒湯組肺組織W/D比明顯降低(P<0.05)。見表4。

3 討論

膿毒癥已經(jīng)成為影響人類健康的重要問題，隨著創(chuàng)傷、燒傷、大手術(shù)等事件發(fā)生率升高，膿毒癥的發(fā)生率呈現(xiàn)上升的趨勢，具有高發(fā)病率、高死亡率等特點，不僅嚴重影響人類的生命健康，危及生命，而且造成嚴重的醫(yī)療負擔(dān)。膿毒癥常常引起多器官功能障礙，而肺組織是最長受累的器官，容易出現(xiàn)急性肺損傷和呼吸窘迫綜合征。有研究表明，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒癥急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[4]。

表4 各組大鼠肺組織W/D比結(jié)果Table 4 Levels of W/D of lung tissue of rats in each group

細胞因子是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，眾多研究表明，在膿毒癥急性肺損傷過程中，TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB等炎癥因子起到重要的作用。NF-κB是一種真核細胞轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞凋亡等過程。NF-κB是由5種亞基構(gòu)成的同源或異源二聚體，p650是NK-κB是最重要的二聚體，當(dāng)發(fā)生膿毒癥時，受內(nèi)毒素或炎癥因子的影響，NF-κB發(fā)生泛素化降解，p650喪失了對NF-κB的束縛，NF-κB進入到細胞核中，與特定的靶基因序列結(jié)合，促進TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子分泌，進而引起炎癥瀑布級聯(lián)反應(yīng)[7-8]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的起始觸發(fā)因子，可以激活中性粒細胞和單核巨噬細胞分泌IL-1、IL-6等二級炎癥因子，也可以反過來激活NF-κB，形成惡性循環(huán)。NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子在肺組織聚集，直接損傷肺泡上皮細胞，導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)分泌減少，引起肺泡塌陷；也可以引起肺毛細血管通透性增加，導(dǎo)致肺水腫，表現(xiàn)為肺通氣/血流比例失調(diào)，肺容積減少，最后進展為肺纖維化[9]。氧化應(yīng)激在導(dǎo)致膿毒癥急性肺損傷過程中同樣起到重要的作用。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可以直接破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)活性改變；促進肺組織分泌血管活性物，導(dǎo)致肺毛細血管擴張，促進血管內(nèi)物質(zhì)滲透至肺泡或肺間質(zhì)，引起肺水腫；抑制肺泡表面活性物質(zhì)的合成，導(dǎo)致肺泡塌陷，最終引起急性肺損傷[10]。XO是核苷酸的代謝產(chǎn)物，當(dāng)機體內(nèi)XO增加時，提示氧自由基增多，氧化損傷更嚴重[11]。MDA可以反映氧自由基的活性和數(shù)量，提示細胞損傷的程度[12]。SOD是重要的抗氧化物質(zhì)，具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護肺組織的作用[13]。GSH-Px是氧自由基清除酶，可以保護肺組織，防止肺細胞免受脂質(zhì)過氧化的損傷[14]。炎癥因子可以激活氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可以促進炎癥因子釋放，二者形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致肺損傷[15]。

綜上所述，黃連解毒湯具有減輕肺水腫、改善肺通氣、抑制炎癥因子和氧化應(yīng)激的作用。