豬瘟E2亞單位疫苗單劑量免疫攻毒保護(hù)效力試驗(yàn)

王遵寶，李俊輝，王 元，賀 筍，劉宏杰，魯立柱，候玉珍，楊 靜

(天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032)

豬瘟是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種豬高度接觸性傳染病，可造成養(yǎng)豬業(yè)巨大損失。長期以來中國豬瘟防控以免疫豬瘟減毒活疫苗(Modified live vaccine,MLV)為主。近年來，豬瘟亞臨床或隱性感染已經(jīng)成為國內(nèi)常見的臨床類型，國家在豬瘟防控政策也逐漸由免疫防控轉(zhuǎn)向免疫凈化。豬瘟減毒活疫苗的安全性和免疫效力雖毋庸置疑，但由于其不能區(qū)分疫苗毒株與野毒株，很難應(yīng)用于當(dāng)前豬瘟免疫凈化政策中。

豬瘟病毒E2黏膜糖蛋白是主要的保護(hù)性抗原蛋白，它不僅能參與感染過程還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，成為豬瘟亞單位疫苗的主要研究對象[1]。眾多學(xué)者利用不同的技術(shù)策略開發(fā)了多種豬瘟E2亞單位疫苗，并進(jìn)行了全面、細(xì)致的應(yīng)用性研究[2-4]。本試驗(yàn)所用的豬瘟E2亞單位疫苗，是在流行毒株C株E2基因基礎(chǔ)上進(jìn)行了修飾、合成，增加了E2保護(hù)力的廣譜性，同時應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將該E2基因重組于桿狀病毒內(nèi)，在昆蟲細(xì)胞上培養(yǎng)表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗，只誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生E2蛋白抗體，可以通過對E2、E0或NS3蛋白抗體檢測區(qū)分免疫和野毒感染豬，有助于豬場凈化豬瘟。

本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果表明，E2亞單位疫苗2次免疫后的保護(hù)效力與活疫苗相當(dāng)，可為靶動物提供可靠的免疫保護(hù)效力[5]。本試驗(yàn)用臨床中單劑量免疫1次的豬瘟E2亞單位疫苗和免疫2次豬瘟減毒活疫苗的商品豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，通過比較分析攻毒前后靶動物體溫變化、臨床癥狀、病理剖檢變化、豬瘟抗體消長及帶毒情況，綜合評價E2亞單位疫苗單劑量免疫對豬瘟野毒的保護(hù)效力。

1 材料與方法

1.1 疫苗及主要試劑 (1)疫苗：豬瘟E2亞單位疫苗，天康生物股份有限公司提供；豬瘟減毒活疫苗(MLV)，購自某公司。(2)試驗(yàn)動物：長大二元母豬及其所產(chǎn)仔豬。(3)飼料：試驗(yàn)豬教槽料、保育期、育肥期全價顆粒料，均由天康生物飼料事業(yè)部提供。(4)攻毒用毒株：豬瘟石門系強(qiáng)毒，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌毒種保存保藏中心。(5)主要試劑：豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(貨號：99-43220)、豬瘟病毒血清抗原檢測試劑盒(貨號：99-40939)，均購自IDEXX公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計 本試驗(yàn)在新疆某豬場A、B兩區(qū)進(jìn)行，A區(qū)母豬在妊娠中期經(jīng)耳部深層肌肉注射豬瘟E2亞單位疫苗，1頭份/頭，21 d后加強(qiáng)免疫1次；在B區(qū)選擇分娩時間接近的母豬采用相同方式免疫2次MLV，每組免疫不低于180頭。用以上2個區(qū)的免疫母豬所產(chǎn)仔豬進(jìn)行不同豬瘟疫苗對商品豬的有效性試驗(yàn)。

本試驗(yàn)共設(shè)3組，第1組為E2亞單位疫苗組(E2組)，第2組為豬瘟減毒活疫苗組(MLV組)，第3組為非免疫對照組。孕豬分娩后，A區(qū)母豬所產(chǎn)仔中隨機(jī)打耳標(biāo)200頭作為E2組的供試豬，在母源抗體陽性率低于70%時免疫豬瘟E2亞單位疫苗1次。B區(qū)母豬所產(chǎn)仔隨機(jī)選擇200頭在4、8周齡免疫M(jìn)LV 2次，作為MLV組試驗(yàn)豬；另選100頭仔豬不免疫作為非免疫對照組，跟蹤監(jiān)測試驗(yàn)豬體重、豬瘟抗體至24周齡。試驗(yàn)豬的飼養(yǎng)管理及其他疫苗免疫均按本場程序進(jìn)行，保證豬舍正常的通風(fēng)和溫度、濕度。

試驗(yàn)豬24周齡左右時，在3個試驗(yàn)組中各隨機(jī)選取5頭豬運(yùn)至天康生物制藥事業(yè)部檢驗(yàn)動物房，保健3～5 d后用豬瘟石門系強(qiáng)毒進(jìn)行人工感染，根據(jù)試驗(yàn)豬感染后16 d內(nèi)臨床表現(xiàn)、存活率等綜合評價豬瘟E2亞單位疫苗單劑量免疫對靶動物的保護(hù)效力。

1.2.2 采血與抗體監(jiān)測 定期在3個組的供試豬群中隨機(jī)抽樣采血，抽樣量要求每組不低于50頭仔豬/次。采集的血清送天康生物制藥事業(yè)部測定豬瘟抗體。

1.2.3 供試豬增重試驗(yàn) 3個試驗(yàn)組在首次免疫M(jìn)LV前進(jìn)行稱重，免疫后每4周稱重1次，統(tǒng)計不同組試驗(yàn)豬的增重情況，連續(xù)跟蹤監(jiān)測至24周齡。

1.2.4 人工感染 3個試驗(yàn)組的15頭供試豬運(yùn)至檢驗(yàn)動物房后，在獨(dú)立的負(fù)壓區(qū)域中飼養(yǎng)，由3組試驗(yàn)人員單獨(dú)飼喂、觀察，保證有效隔離。豬只保健3～5 d后，用豬瘟病毒石門系血毒1 mL(含105.0最小致死量)經(jīng)耳后頸部肌肉注射進(jìn)行人工感染。

攻毒后每日定時測定并記錄試驗(yàn)豬體溫、死亡情況，觀察臨床癥狀，包括食欲、呼吸、精神狀態(tài)、腹瀉與便秘、結(jié)膜炎、體表是否有出血點(diǎn)等。

攻毒后16 d內(nèi)定期采集試驗(yàn)豬血樣，用于測定豬瘟病毒和特異性抗體。被檢樣本S/N≤0.10，為CSFV陰性；S/N≥0.30，為陽性；0.1

2 結(jié)果

2.1 商品豬抗體監(jiān)測 商品豬不同生長階段豬瘟病毒抗體檢測結(jié)果顯示，MLV組仔豬4周齡母源抗體陽性率為77.78%，4周齡首免后2周陽性率有所下降，二免前升高至80.56%，10～12周齡時抗體陽性率最高，可達(dá)94.44%，之后豬群豬瘟抗體陽性率緩慢下降，至24周齡時陽性率為72.22%。E2組4～8周豬瘟抗體陽性率為100%，10～12周時母源抗體陽性率逐漸下降，12周齡時降至76.47%，用E2亞單位疫苗進(jìn)行免疫，免疫后4周抗體陽性率升至100%，24周齡 時陽性率可達(dá)86.67%。對照組仔豬4周齡母源抗體陽性率與MLV組相近，為75%，此后逐步下降，8周齡時抗體陽性率為15%，10周齡時母源抗體陽性率已降至0%，因此未繼續(xù)跟蹤監(jiān)測。

E2組豬群僅在10～12周齡(首免前2周)抗體阻斷率均值略低于MLV組，離散度較MLV組高，其余監(jiān)測點(diǎn)均優(yōu)于MLV組，即整個監(jiān)測過程，E2組的抗體水平更高，整齊度更好，見表1。

以上結(jié)果表明，豬群單次免疫E2亞單位疫苗后的豬瘟抗體陽性率、阻斷率、離散度略優(yōu)于免疫2次MLV豬群，兩者差異不顯著(P>0.05)。

表1 試驗(yàn)豬群不同生長階段豬瘟病毒抗體監(jiān)測統(tǒng)計分析結(jié)果Table 1 Statistical analysis of ELISA antibody against CSFV at different growth stages in immuned piglets (%)

2.2 生長豬增重試驗(yàn) 在豬場定期將標(biāo)記的商品豬稱重，統(tǒng)計分析了同等飼養(yǎng)條件及免疫背景下不同豬瘟疫苗對其生長性能影響的試驗(yàn)。結(jié)果表明，24周齡時，單次免疫E2亞單位疫苗的商品豬平均體重最高為(101.61±1.95)kg，平均體重為(100.46±2.16)kg，對照組次之，免疫2次MLV的試驗(yàn)豬體重最小，在每個監(jiān)測點(diǎn)各組平均體重差異不顯著(P>0.05)，但E2組與MLV組的凈增重(24周齡體重與4周齡體重之差)差異顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1 免疫不同豬瘟疫苗商品豬體重變化監(jiān)測結(jié)果Fig.1 Results of body weight changes of pigs immunized with different CSF vaccines

2.3 豬瘟病毒人工感染試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)豬攻毒前后體溫及臨床觀察 攻毒后試驗(yàn)豬體溫測定結(jié)果表明，對照豬在攻毒后體溫逐漸升高，攻毒后5～7 d時體溫最高，可達(dá)42 ℃，之后高熱稽留，直至瀕死時體溫有所降低。E2組攻毒后體溫未見升高，每個溫次均不高于基礎(chǔ)體溫1 ℃，觀察期內(nèi)介于38.6～39.6 ℃；MLV組1頭豬在攻毒后6～7 d出現(xiàn)低熱，體溫高于基礎(chǔ)體溫1 ℃，之后恢復(fù)正常，其他豬只體溫正常，見中插彩版圖2。

攻毒后3 d，對照豬活力下降，陸續(xù)表現(xiàn)出精神沉郁、畏寒怕冷、聚集躺臥等狀況；食欲明顯下降；眼睛發(fā)紅，并伴有膿性分泌物，呈典型的結(jié)膜炎癥狀；便秘、腹瀉交替發(fā)生；在攻毒后8 d，2頭豬發(fā)生急性死亡，12 d內(nèi)全部發(fā)病死亡，見中插彩版圖3。E2組未見任何異常；MLV組僅1頭豬有輕微一過性發(fā)熱及厭食癥狀。

2.3.2 病理剖檢 對照組豬只死亡后剖檢可見典型的豬瘟引起的組織、器官病變，如扁桃體潰瘍，膀胱、腎臟表面出現(xiàn)出血點(diǎn)，各部位淋巴結(jié)出血，脾邊緣梗死。E2組剖檢未見異常，結(jié)果見表2和中插彩版圖4、5。MLV組僅發(fā)熱的1頭豬剖檢時在膀胱上發(fā)現(xiàn)出血點(diǎn)，且下頜及腹股溝淋巴結(jié)有輕微腫大、出血，但不能確定是否是由豬瘟病毒引起該病變。

2.3.3 攻毒前后血樣抗體、豬瘟病毒測定 攻毒前E2組CSFV抗體阻斷率均值為74.66%，MLV組為59.83%，陽性率均為100%，對照組CSFV抗體均為陰性。試驗(yàn)結(jié)束時，E2組和MLV組血樣的豬瘟抗體阻斷率均明顯升高，見圖6；對照組的試驗(yàn)豬攻毒后發(fā)病直至死亡，CSFV抗體始終為陰性，提示未免疫個體被豬瘟強(qiáng)毒株感染后，機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制，未能產(chǎn)生豬瘟中和抗體有效阻斷病毒大量增殖，最終形成病毒血癥，導(dǎo)致急性發(fā)病死亡。

攻毒后4 d可在對照組豬血液中持續(xù)檢出豬瘟病毒，直至病豬死亡；攻毒期間E2組豬血液中未檢出豬瘟病毒，MLV組供試豬僅1頭在攻毒后4～8 d的0.1

表2 攻毒后豬剖檢病變統(tǒng)計表Table 2 Results of postmortem lesions in pigs (頭)

圖6 攻讀前后試驗(yàn)豬CSFV Ab阻斷率變化情況Fig.6 Change of CSFV Ab blocking rate in test pigs

圖7 試驗(yàn)豬血樣中CSFV檢測結(jié)果Fig.7 Results of CSFV Ag in swine plasma

3 討論

研究表明，長期、持續(xù)的IgG水平和/或記憶B細(xì)胞激活引起的繼發(fā)性記憶抗體反應(yīng)產(chǎn)生的中和抗體是機(jī)體能夠?qū)笴SFV感染的重要武器[6]。豬只接種MLV疫苗后，豬瘟病毒的復(fù)制可以刺激T、B淋巴細(xì)胞的活化、復(fù)制和分化，從而更有效地產(chǎn)生2種類型的大量記憶細(xì)胞。但對于滅活疫苗而言，局部炎癥反應(yīng)較小，所以通常需要加強(qiáng)免疫以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。隨著佐劑制劑的發(fā)展，亞單位疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)及持續(xù)時間得到了極大的改善。

Hua R H等篩選了能穩(wěn)定產(chǎn)生分泌型豬瘟病毒E2蛋白(ME2)的BHK-21細(xì)胞，用該蛋白與不同佐劑乳化的疫苗免疫動物，一免后2周中和抗體效價為1∶40～1∶320，二免后28周中和抗體效價均仍不低于1∶80，此后將試驗(yàn)豬攻毒，所有免疫豬存活，無明顯豬瘟癥狀，證實(shí)了該蛋白的免疫效力；不同佐劑配制的E2亞單位疫苗免疫動物后存在較大的反應(yīng)差異，水包油佐劑ISA 15A VG誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答快，油包水佐劑ISA 61 VG誘導(dǎo)抗體效價最高，衰減最慢，免疫后32周中和抗體效價仍可高達(dá)1∶10 240，即油性佐劑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答更強(qiáng)，抗體持續(xù)時間長，適合提供長效的免疫保護(hù)[7]。

Madera R等用試驗(yàn)疫苗KNB-E2免疫豬，可在其血清中檢出高水平的E2特異性抗體和抗CSFV中和抗體[8]。免疫后35 d，用 CSFV(Honduras / 1997)毒株經(jīng)肌內(nèi)注射和鼻內(nèi)感染試驗(yàn)豬。單劑量免疫KNB-E2的豬攻毒后持續(xù)生長，未見任何異常臨床表現(xiàn)，僅能在少數(shù)血液和鼻拭子樣品中檢測到低拷貝CSFV核酸，未免疫的對照豬停止生長，持續(xù)發(fā)熱、白細(xì)胞嚴(yán)重減少，表現(xiàn)出典型的豬瘟癥狀，并能在血液及鼻拭子中檢測到高拷貝的CSFV核酸。

Smit A J de等用拜耳的豬瘟E2亞單位疫苗單劑量免疫豬，間隔3、6、13個月后分別人工感染CSFV (Brescia)強(qiáng)毒株[6]。未接種疫苗的對照豬發(fā)生急性豬瘟引起死亡，接種疫苗的豬群具有高水平CSFV中和抗體，全部存活，同群哨兵豬未見異常，表明單次接種E2亞單位疫苗后，不僅可以保護(hù)豬13個月內(nèi)免受CSFV強(qiáng)毒株的攻擊致死，而且阻止了病毒在豬群的水平傳播。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在臨床中單劑量免疫1次豬瘟E2亞單位疫苗，不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的豬瘟病毒E2蛋白特異性抗體，有效保護(hù)商品豬在出欄前免受豬瘟強(qiáng)毒的攻擊，而且降低了免疫過程中抓豬和免疫應(yīng)激造成的生長影響，減小了感染非洲豬瘟的風(fēng)險，可以為豬場減少免疫及勞動力成本，具有重要的推廣意義。