子宮內膜膠原代謝與奶牛不孕癥關系的研究

王國卿，李 琳，陳劭天，張藝君

(東北大學生命科學與健康學院，遼寧 沈陽 110819)

屢配不孕癥是影響奶牛繁殖力的主要原因之一。該病患牛發情周期及發情表現均正常，生殖道也無可見異常，但輸精3次以上仍不能受孕[1]，其在奶牛養殖中的發病率為5%～36%[2]，因產犢間隔延長和產奶量下降導致的經濟損失達150～220歐元/頭[3]。由于其病理機制尚不明確，至今仍缺乏有效的預防和治療手段。胚胎著床失敗是導致母牛不孕的主要原因[4]，著床失敗致使奶牛胚胎死亡率高達7.2%～29%[5]；而胚胎著床不僅取決于胚胎質量，還與子宮內膜接受胚胎的能力密切相關，奶牛子宮內膜微環境是影響妊娠建立的決定性因素[6]。子宮內膜著床微環境主要由子宮內膜細胞和膠原(Collagen,CL)、層粘連蛋白(Laminin,LN)、纖粘連蛋白(Fibronectin,FN)等細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)組分組成，基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是ECM降解和重塑的關鍵酶[7]，通過調節ECM組成和分布以形成著床微環境。特別是MMP-2、MMP-9的顯著高表達[8]，使子宮內膜膠原降解、細胞間連接疏松，為胚泡植入提供必要條件。雌、孕激素水平是奶牛子宮內膜容受性形成的必要條件，而MMP-2、MMP-9對子宮內膜膠原的降解是影響子宮內膜容受性的關鍵原因之一；孕酮對MMPs具有抑制作用，胚胎著床又需要MMPs對ECM的降解，雌、孕激素是通過其受體發揮作用。因此子宮內膜雌激素受體(Estrogen receptor,ESR)和孕激素受體(Progesterone receptor,PGR)與MMPs間作用關系及其對膠原表達的影響，可能在屢配不孕癥中發揮重要作用。為此本研究分析屢配不孕奶牛子宮內膜膠原的表達特點、代謝規律及雌、孕激素受體的調節作用，以探討子宮內膜膠原酶代謝在奶牛子宮不孕癥中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組 胎次為2～6 胎、體重為550～600 kg中國荷斯坦奶牛20頭，由哈爾濱市某奶牛小區提供，其中健康奶牛10頭，為對照組；發情周期及發情表現均正常，生殖道無可見異常，輸精3次以上仍未受孕的屢配不孕癥患牛10頭，為試驗組。

1.2 主要試劑 RNA提取、反轉錄試劑盒及PCR相關試劑、SYBR PremixExTaqII試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司；I、IV型CL抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司；SP通用型免疫組化檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；凝膠成像系統，購自美國BIO-RAD公司；全自動顯微鏡，購自德國Leica公司；Simple PCI圖像分析系統，購自美國Compix公司。

1.4 樣品采集 對照組與試驗組奶牛于人工授精前利用子宮內膜活檢采樣器進行活體采樣，以直腸把握法將采樣器送入孕角，打開開口，用手經直腸將子宮壁按壓到開口上，閉合開口時將子宮內膜切下并取出，按試驗要求分別于液氮和-20 ℃保存，或4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 子宮內膜膠原表達的測定 子宮內膜樣品經4%多聚甲醛固定4～6 h，常規石蠟切片，片厚6～8 μm，脫蠟至水，按照通用型SP試劑盒說明書操作：3% H2O2室溫處理5～10 min以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次；0.4%胃蛋白酶抗原修復；滴加一抗并孵育，然后滴加二抗孵育后，DAB溶液顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片。Leica全自動顯微鏡進行觀察，選取代表性區域，以4×5序列方式連續取20個高倍視野(400倍)，用Simple PCI圖像分析系統進行分析，計算積分光密度(iOD)。

1.6 子宮內膜MMPs、PGR、ESR基因的測定 根據GenBank 中牛MMP-2、MMP-9、ESR-1、PGR和β-actin基因序列，應用Primer Premier 5.0 設計并合成5對特異性引物 (見表1)。子宮內膜組織總RNA 的提取、反轉錄均按相應試劑盒說明書進行操作。引物由上海捷瑞生物技術有限公司合成。

表1 引物序列及目的片段長度Table 1 Primer sequence and amplified fragment length

按照 SYBR PremixExTaqII試劑盒說明書，選用20 μL體系進行熒光定量PCR：ddH2O 5.6 μL，SYBR PremixExTaqII 10 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，模板cDNA 2 μL。反應條件：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、60 ℃ 34 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，每個樣品3個重復。應用ABI Step One熒光定量PCR儀進行擴增反應，數據用PCR儀自帶軟件分析。

1.7 統計方法 采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用一維方差對試驗結果進行差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 子宮內膜膠原的表達 子宮內膜中Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原免疫組化染色結果見中插彩版圖1，利用Simple PCI圖像分析系統進行分析得到iOD 結果見表2。試驗組子宮內膜中Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原的表達量均高于對照組，且差異極顯著(P<0.01)。

表2 子宮內膜Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原免疫組化染色分析結果Table 2 Immunohistochemical analysis of collagen Ⅰ and collagen Ⅳ in endometrium (iOD,×103,n=10)

2.2 子宮內膜PGR、ESR、MMP-2、MMP-9 mRNA的表達 奶牛子宮內膜PGR、ESR、MMP-2、MMP-9 mRNA表達的熒光定量PCR分析結果見圖2，可見試驗組MMP-2、MMP-9、PGRmRNA的表達量均顯著低于對照組，且差異顯著(P<0.05)；ESRmRNA表達在試驗組與對照組間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 子宮內膜PGR、ESR、MMP-2、MMP-9 mRNA表達的測定結果Fig.2 The expression of PGR,ESR,MMP-2 and MMP-9 mRNA in endometrium*:P<0.05,與對照組相比差異顯著*:P<0.05,the difference was significant compared with the control group

3 討論

受精卵未形成或胚胎著床障礙是屢配不孕的主要原因之一，胚胎著床的關鍵在于有著床能力的胚胎和有接受胚胎能力的子宮內膜在時間和空間上的同步性[9]。在著床期子宮內膜局部膠原及細胞外基質被降解，以形成利于著床的子宮內膜微環境，但當膠原表達過高時，導致子宮內膜致密，從而阻礙胚胎的著床植入。Ⅳ型膠原主要分布在基底膜，形成網狀結構，支持基底膜與細胞間粘附并有濾過功能，Ⅳ型膠原作為膠原纖維具有抑制細胞DNA的合成，限制細胞增殖速度的作用。研究表明，隨著Ⅳ型膠原在子宮內膜組織中表達增高,細胞DNA的合成速度受到抑制，也可導致胚泡發育不良和胚胎著床失敗[10]。本研究表明，屢配不孕患牛子宮內膜中Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原的表達量均極顯著(P<0.01)高于正常對照組，高表達的膠原使子宮內膜致密，阻礙著床，同時還對胚泡發育產生不利影響，導致著床失敗。

MMPs是細胞外基質ECM降解和重塑的關鍵酶，通過降解ECM來調控子宮內膜著床微環境。Ping X 等[11]研究表明，MMP-9 蛋白在子宮內膜腺上皮細胞、腔上皮細胞和基質細胞的表達水平較高，有利于子宮內膜細胞外基質的降解，使細胞間連接疏松，便于絨毛滋養層細胞穿透母體子宮內膜；同時，有些MMPs 可被其他MMPs 家族成員(如MMP-2、MMP-3、MMP-7) 激活后發揮生物學作用[12]。丁峰等[13]研究發現早孕期TIMP-2 與MMP-2 的表達與滋養細胞的侵潤活性成正比，可以推測滋養層細胞在浸潤時可能也是MMP-2 起主導侵襲和轉移的作用。由此可見，膠原酶對膠原的降解是限制和影響胚胎著床的關鍵因素之一。本研究發現，屢配不孕奶牛子宮內膜MMP-2、MMP-9 mRNA的表達量均顯著低于對照組(P<0.05)，說明膠原酶MMP-2、MMP-9 mRNA的低表達，使MMP-2、MMP-9對膠原的降解減弱，致使Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原蓄積，是子宮內膜致密，限制胚胎著床。

雌激素和孕酮調控生殖行為不僅取決于激素本身的分泌與代謝，還依賴于其子宮內膜受體的表達。盡管屢配不孕奶牛的生殖激素水平與健康牛相比無顯著改變，但其雌激素受體與孕酮受體的改變也會影響到子宮內膜機能。在本研究中，屢配不孕牛子宮內膜孕酮受體的表達顯著降低(P<0.05)，說明子宮內膜孕酮受體的低表達可能與胚胎著床失敗有關，但是否對膠原酶及膠原的表達產生影響，還有待進一步研究。