豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬鼻支原體雙重PCR檢測方法的建立

修曉娜，李天芝，于新友

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264670；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)能感染豬引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)[1]。PRRS臨床表現(xiàn)主要為母豬繁殖障礙及生長豬呼吸道癥狀[2-4]。PRRSV感染豬后，導(dǎo)致豬免疫系統(tǒng)受損，形成免疫抑制，從而繼發(fā)各種疾病，致豬死亡率增加[5]。豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)感染豬后能引起豬肺炎、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性漿膜炎、中耳炎、結(jié)膜炎等多種疾病[6]，3～10周齡仔豬多發(fā)[7]，與其他豬病混合感染后，加重病情[8]。Mhr是豬鼻腔、氣管、支氣管黏液中的常在菌，10%母豬和40%斷奶仔豬呼吸道黏液中均有該菌存在[9]。近年來，Mhr引起的疾病增加，對(duì)豬場危害嚴(yán)重[10-11]。Mhr和PRRSV常發(fā)生混合感染，導(dǎo)致豬發(fā)病嚴(yán)重[12]。有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測PRRSV 和Mhr的方法，以便及時(shí)采取合理措施進(jìn)行科學(xué)防控。筆者根據(jù)PRRSVORF7和MhrP37基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了同時(shí)檢測2種病原的方法，并應(yīng)用于臨床病料檢測，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌毒株及檢測樣品 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬鼻支原體(Mhr)、豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)、豬肺炎支原體(Mhp)、副豬嗜血桿菌(Hps)、豬鏈球菌(S.suis)由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)DH5α，購自百泰克生物科技有限公司；臨床檢測樣品為2018年1月-2018年11月采自魯北地區(qū)豬場疑似PRRSV和Mhr感染的豬肺臟組織。

1.2 主要試劑 AxyPrep體液病毒核酸小量提取試劑盒，購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；Premix Tag、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker DL-2 000，購自百泰克生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒和多功能DNA純化回收試劑盒，均購自北京百泰克生物科技有限公司；pMD18-T載體，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；LB液體培養(yǎng)基、1×TAE電泳緩沖液，均由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用DNASTAR軟件分別對(duì)GenBank中收錄的PRRSVORF7基因和MhrP37基因序列進(jìn)行分析比對(duì)后，分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 PCR引物Table 1 PCR Primer

1.4 病原核酸提取 分別吸取PRRSV、CSFV、PCV2、PRV共4種病毒液200 μL，按照病毒核酸提取試劑盒的說明書提取病毒核酸，最后用40 μL洗脫液洗脫。分別吸取Mhr、Mhp、APP、Hps、S.suis共5種菌液，按照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，最后用100 μL洗脫液洗脫，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單項(xiàng)PCR檢測方法的建立 首先用無核酸酶滅菌純化水分別稀釋引物PRRSV-F、PRRSV-R和Mhr-F、Mhr-R，使得其終濃度均15 μmol/L，分別以PRRSV-F和PRRSV-R為引物，PRRSV RNA為模板，Mhr-F和Mhr-R為引物，Mhr基因組DNA為模板，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了PRRSV和Mhr單項(xiàng)PCR檢測方法。

1.6 雙重PCR檢測方法的建立 按照OneStep RT-PCR Kit Ver.2說明書進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，總體系20 μL，其中2×1 Step Buffer 10 μL，PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 0.8 μL，PRRSV RNA 1 μL，Mhr基因組DNA 1 μL，引物在反應(yīng)體系中的加入量不斷優(yōu)化，并用水補(bǔ)充剩余體系，瞬時(shí)離心后，放入 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋悍崔D(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min，預(yù)變性 95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 25 s，退火55 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。分別采用48～60 ℃的退火溫度(每次遞增1 ℃)。篩選最佳引物加入量和最佳退火溫度。

1.7 特異性試驗(yàn) 分別取PRRSV和Mhr核酸1.0 μL，混合后作為PCR反應(yīng)模板，另取PRRSV、Mhr、CSFV、PCV2、PRV、Mhp、APP、Hps、S.suis核酸各2 μL。采用本試驗(yàn)建立的PRRSV和Mhr雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，以確定所建方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 分別回收1.6中PRRSV和Mhr擴(kuò)增產(chǎn)物234 bp和737 bp目的基因片段，連接pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒后，并送測序公司進(jìn)一步驗(yàn)證，測序正確后，紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度以及純度，作陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分別作10倍倍比梯度系列，取相應(yīng)稀釋度等量混合，用優(yōu)化后PCR檢測方法進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，確定方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別選取6份確定為PRRSV細(xì)胞毒和4份確定為Mhr培養(yǎng)液，提取核酸后，采用本試驗(yàn)建立的PRRSV和Mhr雙重PCR進(jìn)行檢測，每種樣品均重復(fù)3次，以確定方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性是否良好。

1.10 臨床樣品的檢測 從魯北地區(qū)豬場采集疑似PRRSV、Mhr感染病例的肺臟作為病料樣品，共采集85份病料樣品。病料樣品處理后，提取總核酸，采用所建方法進(jìn)行PRRSV和Mhr的檢測，并同時(shí)進(jìn)行單項(xiàng)PCR檢測，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV和Mhr單項(xiàng)PCR檢測方法的建立 PRRSV單項(xiàng)PCR的引物加入量為1.5 μL PRRSV-F(15 μmol/L)、1.0 μL PRRSV-R(15 μmol/L)，反應(yīng)程序?yàn)椋悍崔D(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min，預(yù)變性 95 ℃ 30 min，變性95 ℃ 15 s，退火54 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)。Mhr單項(xiàng)PCR引物加入量為0.8 μL Mhr-F(15 μmol/L)、2.1 μL Mhr-R(15 μmol/L)。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性 95 ℃ 30 min，變性95 ℃ 10 s，退火52 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。

2.2 雙重PCR檢測方法 通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系中引物加入量和擴(kuò)增反應(yīng)程序，最終確定的PRRSV和Mhr雙重PCR檢測方法的最佳引物的加入量為1.2 μL PRRSV-F(15 μmol/L)、1.4 μL PRRSV-R(15 μmol/L)、0.6 μL Mhr-F(15 μmol/L)、1.8 μL Mhr-R(15 μmol/L)。優(yōu)化后最佳的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋悍崔D(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min，預(yù)變性 95 ℃ 30 min，變性95 ℃ 15 s，退火53 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。

2.3 特異性試驗(yàn) 采用建立的雙重PCR方法對(duì)PRRSV+Mhr、PRRSV、Mhr、CSFV、PCV2、PRV、APP、Mhp、Hps、S.suis核酸擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PRRSV+Mhr可擴(kuò)增2條特異性基因片段，大小約234 bp和737 bp，以單一的PRRSV核酸為模板時(shí)擴(kuò)增出1條特異性基因片段，大小約234 bp，以Mhr DNA為模板時(shí)可擴(kuò)增出約737 bp基因片段，而CSFV、PCV2、PRV、APP、Mhp、Hps、S.suis核酸，則無任何擴(kuò)增條帶，說明所建立的方法特異性好(圖1)。

2.4 敏感性試驗(yàn) 分別根據(jù)PRRSV和Mhr質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算拷貝數(shù)，PRRSV和Mhr質(zhì)粒拷貝數(shù)分別為4.2×1010拷貝/μL和1.8×1010拷貝/μL。PRRSV質(zhì)粒稀釋為4.2×109、4.2×108、4.2×107、4.2×106、4.2×105、4.2×104、4.2×103、4.2×102拷貝/μL和4.2×101拷貝/μL共9個(gè)不同的稀釋度。Mhr質(zhì)粒稀釋為1.8×109、1.8×108、1.8×107、1.8×106、1.8×105、1.8×104、1.8×103、1.8×102拷貝/μL和1.8×101拷貝/μL共9個(gè)不同的稀釋度，分別取108～101拷貝/μL的PRRSV和Mhr質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，同等稀釋度等量混合后作為模板。用雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該法對(duì)PRRSV的最低檢測限度為420 拷貝/μL，對(duì)Mhr的最低檢測限度為180 拷貝/μL(圖2)，與單項(xiàng)PCR檢測敏感性一致(圖3，圖4)，表明所建方法具有很好的敏感性。

圖1 特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity determinationM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1：PRRSV和Mhr;2：PRRSV；3：Mhr;4：CSFV;5：PCV2;6：PRV;7：APP;8：Mhp;9：Hps;10：S.suisM：DL-2 000 DNA Marker;1：PRRSV and Mhr;2：PRRSV;3：Mhr；4：CSFV;5：PCV2;6：PRV;7：APP;8：Mhp;9：Hps;10：S.suis

圖2 雙重PCR敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity determination of the duplex PCRM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1～8：PRRSV和Mhr質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為108～101 拷貝/μLM：DL-2 000 DNA Marker;1～8：The copies of PRRSV and Mhr plasmids were 108～101 copies /μL

圖3 PRRSV單項(xiàng)PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity determination of PRRSV single PCRM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～8：PRRSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為108～101 拷貝/μLM：DL-2 000 DNA Marker；1～8：The copies of PRRSV plasmids were 108～101 copies /μL

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 用核酸提取試劑分別提取6份 PRRSV細(xì)胞毒和4份Mhr培養(yǎng)液核酸，以所建立的雙重PCR檢測方法檢測，并重復(fù)3次，結(jié)果顯示，3次結(jié)果一致，均為陽性，表明所建方法穩(wěn)定性好。

2.6 臨床樣品的檢測 對(duì)采集的85份臨床疑似PRRSV、Mhr感染肺臟樣品，分別用PRRSV和Mhr雙重PCR進(jìn)行檢測，并且每份核酸同時(shí)做PRRSV單項(xiàng)PCR、Mhr單項(xiàng)PCR檢測，檢測結(jié)果分析，雙重PCR和單項(xiàng)PCR的檢測結(jié)果一致，符合率為100%，共檢測PRRSV陽性樣品25份，Mhr陽性樣品13份，其中6份為PRRSV和Mhr混合感染樣品(表2)，表明所建立的雙重PCR檢測PRRSV和Mhr效果好，可用于臨床樣品的檢測。

圖4 Mhr單項(xiàng)PCR敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity determination of Mhr single PCRM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1～8：Mhr質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為108～101 拷貝/μLM：DL-2 000 DNA Marker;1～8：The copies of PRRSV plasmids were 108～101 copies /μL

表2 單項(xiàng)PCR與雙重PCR檢測對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of single PCR and double PCR detection comparative test

3 討論

自2006年高致病性PRRSV暴發(fā)以來，PRRS成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[13]。隨著疫苗的廣泛應(yīng)用，豬場PRRSV每年都在發(fā)生變異，但發(fā)生變異的基因主要是NSP2基因[14]，當(dāng)前豬場呈現(xiàn)PRRSV多毒株共存的局面，PRRSV的防控工作變得更復(fù)雜[15]。本試驗(yàn)根據(jù)PRRSV變異小的ORF7基因設(shè)計(jì)引物，能覆蓋豬場各種類型PRRSV毒株，避免漏檢。PCR檢測為PRRSV陽性時(shí)并不能說明豬場暴發(fā)PRRS，要得出可靠的結(jié)果還需要根據(jù)豬場PRRS疫苗的免疫情況和豬場的狀態(tài)，有時(shí)還需要配合病理切片，才能做出科學(xué)的判斷。不同PRRS疫苗有不同帶毒和排毒期，當(dāng)豬場不穩(wěn)定，豬群有PRRS相關(guān)癥狀和病變，同時(shí)PCR檢測為PRRSV核酸陽性時(shí)，可以按PRRS暴發(fā)采取相應(yīng)緊急防控措施。

豬支原體病主要由肺炎支原體、滑液支原體和Mhr等3種支原體引起[16]，3種支原體間交叉保護(hù)性差。目前豬肺炎支原體有商品化的滅活疫苗和活疫苗，在豬肺炎支原體病的防控中發(fā)揮了很好的作用。滑液支原體主要影響大豬，發(fā)生關(guān)節(jié)病變，一般不會(huì)致死豬，Mhr可導(dǎo)致豬呼吸道疾病，1～3月齡豬多發(fā)，沒有疫苗預(yù)防[17]，因此，豬場必須重視。對(duì)Mhr引起的疾病，雖可用林可霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療，但容易產(chǎn)生耐藥性，效果不理想[18]。只能采取綜合性防控措施，如加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高豬只機(jī)體抗病力。飼喂優(yōu)質(zhì)飼料，禁止喂霉變飼料。豬舍做好保溫和通風(fēng)工作，保持豬舍清潔衛(wèi)生，做好消毒工作，定期通風(fēng)、降低氨氣濃度、減少飼養(yǎng)密度、減少應(yīng)激以降低Mhr相關(guān)疾病發(fā)病率和病情的嚴(yán)重程度。

筆者根據(jù)PRRSVORF7基因和Mhr最為保守的種屬基因P37基因，分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，優(yōu)化體系中引物加入量和反應(yīng)程序，首次建立了PRRSV和Mhr雙重PCR檢測方法，對(duì)PRRSV和Mhr的最低檢測限度分別為420 拷貝/μL和180 拷貝/μL，與單項(xiàng)PCR檢測，敏感性一致，說明同一體系中擴(kuò)增2種病原并未產(chǎn)生嚴(yán)重抑制作用，具有較高的靈敏性，大大簡化了操作步驟，節(jié)約了時(shí)間，提高了檢測效率。在病料檢測中有一些創(chuàng)新，更加實(shí)用，按以往的觀念需要PRRSV提取RNA、豬支原體提取DNA，并分開進(jìn)行擴(kuò)增，操作非常繁瑣，不但需要提取2種核酸，擴(kuò)增時(shí)還需要分開加樣，分開擴(kuò)增，需要時(shí)間長，或同時(shí)占用2臺(tái)PCR儀器。而筆者進(jìn)行了創(chuàng)新，病料研磨后，1 000 r/min低速離心，保證大的組織塊下沉，而上清內(nèi)含病毒和支原體，后用吸附柱式法同時(shí)提取PRRSV和Mhr核酸，配合小型高速離心機(jī)，操作簡便，半小時(shí)內(nèi)即能提完核酸，提取的核酸質(zhì)量較高，能達(dá)到PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求，不存在PCR反應(yīng)抑制物，且所有試劑均能常溫保存和運(yùn)輸。通過對(duì)85份臨床疑似病料樣品檢測結(jié)果顯示，所建立的PRRSV和Mhr雙重PCR和單項(xiàng)PCR結(jié)果一致，符合率為100%，說明所建方法檢測臨床樣品效果好。下一步筆者打算將除模板外試劑凍干，適合常溫保存和運(yùn)輸，使用時(shí)只要加入滅菌水和模板即能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)一步簡化加樣步驟，使得病原檢測更便捷。