片仔癀對LncRNA-ANRIL 介導大腸癌淋巴管新生的影響

逯 遙 ，張 敏 ，劉 潔 ，毛倩倩 ，曹治云 ，林久茂 *

1 福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；

2 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122；

3 中西醫結合基礎福建省高等學校重點實驗室（福建中醫藥大學），福建 福州 350122

大腸癌（colorectal cancer，CRC）包括結、直腸癌，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。 據美國癌癥協會的最新統計數據，全球每年新增大腸癌發病例數接近109.6 萬，且造成超過50%（＞50 萬）患者的死亡［1］，造成大腸癌高死亡率的原因是大多數患者在診斷時已是晚期且伴有轉移不適合手術。 淋巴結轉移是大腸癌最常見和最早出現的轉移方式，大腸癌淋巴管新生是其淋巴結轉移及其復發的主要因素和機制［2］，其發生機制涉及多個癌基因和抑癌基因的表達及長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）表觀遺傳學調控等，是一個多基因、多途徑、多步驟的協同積累過程［3］。 血管內皮生長因子-C（VEGF-C）是目前公認最主要的促淋巴血管生成因子，而抑制大腸癌細胞VEGF-C 的表達，可抑制其淋巴管新生，進而防止大腸癌細胞的轉移［4-5］。 長鏈非編碼RNA-ANRIL（LncRNA-ANRIL）是長度為3.8 kb 的一種LncRNA，與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關［6］。最新研究表明，在結直腸癌患者中LncRNA-ANRIL 顯著過表達，且ANRIL 高表達患者的5 年生存率明顯低于ANRIL 低表達患者，有趣的是還發現ANRIL 高表達的患者也有較高的VEGF-C 表達， 因此推測LncRNA-ANRIL 可通過調控促淋巴管新生關鍵因子VEGF-C 的表達促進大腸癌淋巴管新生，從而導致大腸癌淋巴管轉移［3］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）對多種惡性腫瘤的臨床療效顯著，且無明顯毒副作用［7］。實驗研究發現PZH 可通過抑制VEGF-C 信號通路抑制大腸癌淋巴管新生，同時通過調控多條信號通路，誘導大腸癌細胞凋亡，抑制大腸癌細胞增殖、轉移和血管新生等［4，8-10］，但其作用機制仍未闡明，以及未見從LncRNA-ANRIL 方面探討PZH 抑制腫瘤淋巴管新生的報道。 因此，本文在此基礎上研究PZH 抑制LncRNA-ANRIL 介導大腸癌淋巴管新生的作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株

PZH 由漳州片仔癀藥業股份有限公司提供（批號：1808087）；人大腸癌 HCT-116 細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；人淋巴內皮細胞（HLEC），購自廣州吉尼歐生物科技有限公司，細胞均保存于福建中醫藥大學中西醫結合研究院醫學實驗中心液氮中。

1.2 實驗試劑

RPMI1640 培養基（批號：C11875500BT）、胎牛血清（FBS，批號：10099141）、0.25% EDTA-胰酶（批號：25200072），購自美國 Life 公司；青-鏈霉素混合液（雙抗，批號：sv30010）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：SH30256.01B），購自美國 Hyclone 公司；ECM 培養基（批號：28475）、P／S 溶液（批號：27670）、ECGS（批號：27888）、FBS（批號：27849），購自 Scien Cell生物技術公司；CCK-8（批號：k1018-1），購自美國APExBIO 公司；結晶紫粉末（批號：C8470），購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell 小室（批號：3422），購自美國Corning 公司；管腔形成試劑盒（批號：ECM625），購自德國 Merck Millipore 公司；聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（批號：23227）、SYBRTMSelect Master Mix 試劑（批號：4472908）、Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑（批號：13778-030），購自美國 Thermo 公司；Super ECL Star（超敏化學發光檢測試劑盒）（批號：S-6009），購自中國宇恒生物公司；細胞裂解液（Pierce RIPA Buffer，批號：AR0102-100），購自中國博士德生物工程有限公司；磷酸酶抑制劑（PhosStop，批號：4906837001 ） 、 蛋 白 酶 抑 制 劑 （Cocktail， 批 號4693124001），購自瑞士Roche 公司；苯甲基磺酰氟（PMSF，批號：ST506），購自中國碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE 配膠試劑盒（批號：CW0022M），購自北京康為世紀生物科技有限公司；β-actin（批號：60008-1-Ig）、GAPDH 抗體（批號：60004-1-lg）、VEGF-C 抗體（批號：22601-1-AP）、二抗（鼠抗）（批號：SA00001-1）和二抗（兔抗）（批號：SA00001-2），均購自武漢三鷹生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，批號：RR047A），購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；Si-NC 和Si-ANRIL 的序列，購自上海吉瑪制藥有限公司。

1.3 主要儀器

CO2培養箱（美國 Thermo 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；倒置顯微鏡系統（德國Leica儀器有限公司）；Countes?全自動細胞計數儀（美國Life 公司）；連續波長多功能酶標儀（奧地利TECAN公司）；電泳儀、電泳槽、小型轉膜儀、化學發光成像系統（美國Bio-Rad 公司）；7500 Fast 熒光定量PCR儀（美國 ABI 公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物及試劑的配制

PZH 在研缽中研成細粉末后，用PBS 配制成25 mg／mL 溶液，超聲溶解 30 min，用 0.45 μL 孔徑的濾膜過濾，經高壓滅菌后于-20 ℃貯存備用。 RPMI 1640 完全培養基含10% FBS 和1%雙抗，4 ℃冰箱保存備用。 ECM 完全培養基含5%FBS 和1%P／S溶液、1%ECGS，4 ℃冰箱保存備用。

2.2 細胞培養

HCT-116 細胞用RPMI1640 完全培養基培養，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，細胞單層貼壁生長，待細胞密度達到80%～90%時，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，后加入2 mL 的完全培養基終止消化后，1 000 r／min 離心 3 min，棄上清收集沉淀細胞，用完全培養基重懸制成新細胞懸液后傳代。HLEC 于ECM 完全培養基中培養，按1.0×105個 ／mL 接種到 6 孔板中（2 mL／孔），此時培養 基為轉染后收集的腫瘤培養上清（tumor culture su-pernatants，TSNs）， 分為 Si-NC 組、Si-ANRIL 組、Si-NC+PZH（0.25 mg／L）組，每組 3 個重復。

2.3 細胞活力檢測

HCT-116 細胞按 1.5×105個 ／mL 接種于 96 孔板中（100 μL／孔），當細胞匯合度達到 50%～60%時，吸走孔中原培養基，每孔加入100 μL 含有不同濃度 PZH（終濃度分別為 0、0.25、0.50、0.75 mg／mL）的完全培養基繼續培養24 h 后，吸棄培養基，每孔加入 100 μL 濃度為 0.5 mg／mL MTT 溶液繼續培養4 h 后，吸棄 MTT 溶液，每孔加入 100 μL DMSO 后，置于酶標儀（波長570 nm）測光密度（A）值。 HCT-116 細胞轉染SiRNA 36 h 后，棄掉培養基，按照說明書將CCK-8 溶液加入到每孔中，繼續培養2 h后，在 450 nm 波長下測 A 值。 HLEC 按1.0×105個 ／mL接種于 96 孔板中（100 μL／孔），在TSNs 中培養 24 h后，CCK-8 檢測細胞活力，操作步驟同上，每個濃度做6 個復孔。

細胞活力（%）＝實驗組 A 值／對照組A 值×100%

2.4 RT-qPCR 檢測 LncRNA-ANRIL 的表達

取對數生長期的HCT-116 細胞按1.0×105個／mL接種于 6 孔板中（2 mL／孔），待細胞匯合度達到50%～60%時，將細胞分成對照組和PZH 組，PZH 組每孔加入不同濃度 PZH（0.25、0.50、0.75 mg／mL）溶液后，繼續培養24 h 后，每孔加RNAiso Plus 1 mL提取RNA，每組做3 個復孔。 NanoDrop1000 核酸檢測儀對RNA 的濃度進行測定，應用PrimeScriptTMmiRNA RT-qPCR kit 進行 Poly（A）加尾反應和反轉錄反應。 RT-qPCR 反應體系 10 μL，即 cDNA 溶液2 μL，SYBRTMSelect Master Mix 5 μL，PCR Forward Primer （10 μmol／L） 0.8 μL，DEPC 2.2 μL，于 7500 Fast PCR 儀進行RNA 表達分析。 通過閾值分析比較，采用循環數（Ct）法對數據進行分析處理。定量采用 2-ΔΔCt法，GAPDH 為內參，計算 LncRNA-ANRIL 的相對表達量。HCT-116 細胞轉染SiRNA 后檢測LncRNA-ANRIL 表達操作步驟同上。 LncRNAANRIL 正向引物：5’-CCGCTCCCCTATTCCCCTTA-3’，反向引物：5’-CCTGATTGGCGGATAGAGCA-3’；GAPDH 正 向 引 物 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAA AAT-3’，反向引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCA TGG-3’。

2.5 細胞轉染

取對數生長期HCT-116 細胞按1.5×105個／mL接種于 6 孔板中（2 mL／ 孔），培養 24 h 后，用Lipofectamine RNAi MAX 轉染試劑沉默LncRNAANRIL 的表達，轉染體系如下：6 孔板終體積為1 mL，Si-NC 和 Si-ANRIL 的濃度為 50 nmol／L，2.5 μL／孔，加于 6 孔板，Lipofectamine RNAi MAX 3 μL／孔。于轉染后6 h 換成RPMI1640 完全培養基繼續培養，轉染36 h后做后續檢測：① 倒置顯微鏡對細胞的形態變化進行觀察并拍照；② RT-qPCR 檢測LncRNA-ANRIL 表達；③CCK-8 實驗檢測細胞活力；④Western blot 檢測細胞促淋巴管新生因子VEGFC 蛋白表達。 Si-NC 序列：正向 5’-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3’，反向 5’-ACGUGACACGUUCG GAGAATT-3’；Si-ANRIL 序列：正向 5’-GCAUAUG UCUUUCUGGUAUTT-3’，反向 5’-AUACCAGAAA GACAUAUGCTT -3’。細胞活力檢測做6 個重復，其余做3 個重復。

2.6 Western blot 實驗

采用 Western blot 法，將不同濃度 PZH 干預HCT-116 細胞24 h 后和HCT-116 細胞敲減LncRNA-ANRIL 后的細胞裂解、變性，上樣量為每孔50 μg蛋白，電泳條件：10 min 30 V、30 min 80 V、60 min 120 V，轉膜條件：40 min 100 V。 5%的脫脂奶粉封閉 1 h 后，加入 VEGF-C 抗體、GAPDH 抗體或 βactin 抗體，于4 ℃搖床孵育過夜，然后加入第二抗體室溫孵育1 h 后，TBST 漂洗3 次，用超敏化學發光檢測試劑，在Bio-Rad 化學發光成像系統進行成像。

2.7 腫瘤培養上清的制備

HCT-116 細胞分為 Si-NC、Si-ANRIL、Si-NC+PZH 3 組，細胞轉染同前所述，分別于轉染后6 h 換成RPMI1640 完全培養基繼續培養，于6 h 后再次換液，其中Si-NC+PZH 組更換為含PZH 0.25 mg／mL的培養基，再繼續孵育24 h 后收集細胞培養上清液，即腫瘤培養上清，以3 000 r／min 離心15 min，去除細胞碎片及雜質后用于培養HLEC。

2.8 Transwell 小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

① 遷移實驗：HLEC 用TSNs 干預培養24 h 后，吸棄各孔溶液，分別進行消化，用不含FBS 的培養基重懸細胞，按每孔0.2 mL 含5×104個細胞種于Transwell 上室，下室加入 0.7 mL 完全 ECM 培養基后，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中；9 h 后上室和下室分別用0.2 mL 和0.7 mL 4%多聚甲醛固定15 min，吸棄4%多聚甲醛后，用結晶紫染色液染色20 min，吸棄結晶紫，用棉簽小心擦去Transwell 上室的細胞，最后在倒置顯微鏡拍照。 ② 侵襲實驗：將細胞接種至有Matrigel 基質膠的Transwell 上室，其余操作步驟同遷移實驗操作步驟。 每組均做3 個重復遷移和侵襲實驗。

2.9 管腔形成實驗檢測細胞管腔形成能力

預先鋪好基質膠于48 孔板中，基質膠用稀釋液按照 1∶9 稀釋，100 μL／孔鋪膠，放于 37 ℃、5% CO2培養箱凝 1～2 h。HLEC 用 TSNs 干預培養 24 h 后，重新消化、離心、重懸、計數以 5×105／mL 接種于預鋪好的培養板中，3～5 h 拍照，隨機選取3 個視野，采集圖像。 每組做3 個重復。

2.10 統計學方法

3 結 果

3.1 不同濃度PZH 抑制大腸癌細胞HCT-116 的活力、LncRNA-ANRIL 及 VEGF-C 的表達

MTT 實驗結果顯示：與對照組比較，PZH（0.25、0.50、0.75 mg／mL）組的細胞活力明顯降低（P＜0.01）。 PZH 組抑制率分別為（18.46±3.84）%、（36.43±3.49）%、（54.09±2.03）%，見圖 1A。 RT-qPCR 結果顯示：與對照組比較，PZH 可降低HCT-116 中 LncRNA-ANRIL 的表達（P＜0.01），見圖1B，以上結果均呈濃度依賴性。Western blot 結果顯示：與對照組比較，PZH（0.25、0.50、0.75 mg／mL）組可下調HCT-116 細胞中VEGF-C 的蛋白表達，見圖1C。

3.2 LncRNA-ANRIL 沉默對大腸癌細胞活力和VEGF-C 蛋白表達的影響

HCT-116 細胞轉染 SiRNA 后，RT-qPCR 檢測結果顯示：Si-ANRIL 組 LncRNA-ANRIL 表達［（0.50±0.18）%］顯著低于 Si-NC 組［（1.07±0.34）%］（P＜0.05），見圖 2A。 倒置顯微鏡觀察結果顯示：Si-ANRIL 組細胞密度明顯較Si-NC 組少，見圖 2B。 CCK-8 檢測結果顯示：Si-ANRIL 組的細胞活力顯著低于 Si-NC 組（P＜0.01），見圖 2C。Western blot 分析結果顯示，沉默LncRNA-ANRIL后可明顯下調促淋巴管新生因子VEGF-C 的蛋白表達，見圖2D。

圖 1 PZH 抑制 HCT-116 細胞活力、LncRNA-ANRIL 和VEGF-C 蛋白的表達Figure 1 PZH inhibited proliferation of HCT-116 cells，and expression of LncRNA-ANRIL and VEGF-C

3.3 PZH 對 LncRNA-ANRIL 介 導 的 HLEC 活力的影響

HLEC 培養于 TSNs 中，CCK-8 實驗結果顯示：與 Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組的細胞活力顯著降低（P＜0.01），2 組抑制率分別為（8.07±1.89）%和（10.87±4.10）%，見圖 3。

3.4 PZH 對 LncRNA-ANRIL 介 導 HLEC 遷 移能力的影響

HLEC 培養于TSNs 中，遷移實驗結果顯示：與Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組 和 Si-NC+PZH 組的遷移數量顯著減少，2 組的遷移率分別為（83.06±3.70）%、（71.77±8.50）%，見圖 4。

圖2 LncRNA-ANRIL 沉默抑制HCT-116 細胞活力及VEGF-C 蛋白表達（×200）Figure 2 Silencing LncRNA-ANRIL inhibits cell viability and protein expression of VEGF-C in HCT-116 cells （×200）

圖3 PZH 對LncRNA-ANRIL 介導的HLEC 活力的影響Figure 3 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated HLEC viability

3.5 PZH 對 LncRNA-ANRIL 介導 HLEC 侵襲能力的影響

HLEC 培養于TSNs 中，侵襲實驗結果顯示：與Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組的侵襲數量顯著減少（P＜0.01），分別為（67.39±5.75）%和（57.25±1.26）%，見圖 5。

3.6 PZH 對 LncRNA-ANRIL 介導 HLEC 管腔形成能力的影響

HLEC 培養于TSNs 中，管腔形成實驗結果顯示：與 Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組的管腔形成數量顯著減少（P＜0.01），見圖6。

4 討 論

大腸癌作為我國發病率第4 位、死亡率第5 位的惡性腫瘤，每年發病例數約28.2 萬，每年死亡病例約 13.61 萬，嚴重危害國人生命健康［11］。以手術為主的綜合治療是目前大腸癌治療的主要手段，但仍有50%的患者在根治術5 年內發生轉移和復發［12］，其中淋巴結轉移是大腸癌最常見和最早出現的轉移方式，而淋巴管新生是其淋巴結轉移及其復發的主要因素和機制［2］。 淋巴管新生主要指在某些病理狀態時，淋巴內皮細胞受趨化因子作用而遷移至局部組織，然后在內皮生長因子作用下增殖形成新的淋巴管，包括淋巴內皮細胞遷移、增殖和管腔形成等過程［4，13］。

LncRNA-ANRIL 與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關，在腫瘤增殖、侵襲和遷移過程中發揮重要作用，其可通過上調VEGF-C 的表達促進大腸癌淋巴管新生，從而導致大腸癌淋巴管轉移［14-15］。如SUN等［3］研究發現LncRNA-ANRIL 在大腸癌中高表達，且其增高與淋巴結轉移及預后不良密切相關；通過慢病毒轉染下調LoVo 和HCT116 中ANRIL 的高表達，發現細胞遷移和侵襲活性明顯降低，同時也可以抑制人淋巴內皮細胞的管腔形成能力和侵襲能力；此外，在小鼠模型中，ANRIL 下調后，腫瘤生長率和腫瘤大小降低，淋巴結轉移率降低，LMVD 和VEGF-C、VEGFR-3 和 LYVE-1 的表達。 結果表明下調LncRNA-ANRIL 可抑制大腸癌淋巴管生成和轉移。

圖4 PZH 對LncRNA-ANRIL 介導HLEC 遷移能力的影響（×200）Figure 4 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated migration in HLEC （×200）

圖5 PZH 對LncRNA-ANRIL 介導HLEC 侵襲能力的影響（×200）Figure 5 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated invasion in HLEC （×200）

圖6 PZH 對LncRNA-ANRIL 介導HLEC 管腔形成能力的影響（×200）Figure 6 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated tube formation in HLEC （×200）

隨著我國現代化診療技術的飛速發展，針對惡性腫瘤的放化療和分子靶向藥物已廣泛應用于臨床，但是近年來其耐藥和毒副作用也日益顯現，因此臨床療效確切、毒副作用小的中藥復方逐漸受到國內外研究者的重視［16］。 PZH 是由三七、牛黃、蛇膽、麝香等多種名貴中藥材精制而成的復方制劑，具有清熱解毒、消腫散結、活血化瘀、扶正祛邪的功效；在治療大腸癌等惡性腫瘤方面有明確的療效，且無明顯的毒副作用［4，9-10］。本課題組前期實驗研究發現PZH 可通過抑制VEGF-C信號通路抑制大腸癌淋巴管新生，然而PZH 在抑制大腸癌淋巴管新生方面的具體作用機制尚未明確。

本研究中我們用不同濃度的PZH 干預大腸癌細胞 HCT-116，MTT 實驗表明 PZH 可抑制 HCT-116 細胞的活力，RT-qPCR 顯示 PZH 可顯著下調LncRNA-ANRIL 的表達，Western blot 檢測結果表明PZH 可抑制HCT-116 細胞中促淋巴管新生關鍵因子VEGF-C 蛋白的表達，以上結果提示PZH 抗腫瘤淋巴管新生可能與調控LncRNA-ANRIL 和VEGF-C的表達相關。 進一步通過觀察HCT-116 細胞LncRNA-ANRIL 沉默后對其細胞活力、形態及對促淋巴管新生關鍵因子VEGF-C 蛋白表達的影響，結果顯示LncRNA-ANRIL 沉默后可顯著降低HCT-116 細胞密度、活力及VEGF-C 蛋白表達，證實了LncRNA-ANRIL 對VEGF-C 表達的調控作用。在此基礎上我們又收集了HCT116 細胞LncRNA-ANRIL 沉默和加入PZH 后的TSNs 對HLEC進行干預培養，并觀察其對HLEC 活力、遷移能力、侵襲能力和管腔形成能力的影響。 研究結果顯示：與Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組顯著抑制了HLEC 的活力、遷移和侵襲、管腔形成能力，表明PZH 具有抑制LncRNA-ANRIL 介導大腸癌淋巴管新生的作用。 綜上所述，PZH 抑制大腸癌淋巴結轉移的機制，與其抑制LncRNA-ANRIL 表達進而降低VEGF-C 表達，從而抑制大腸癌淋巴管新生有關。