CSE下調抑制MCF-7細胞生長增殖的研究

鄒桃

【摘要】目的：下調或者降低CSE的含量來研究對于乳腺癌細胞MCF-7的生長增殖影響。方法：MCF-7轉染siRNA，western-blot的方法來檢測細胞表達量，將獲得的實驗組和對照組的蛋白含量的灰度值比較，從而確定CSE含量是否得到下調。MTT實驗分別檢測對照組和實驗組細胞生長活力的差異。從而確定CSE下調是否抑制細胞生長。然后通過細胞周期檢測來獲得細胞的生長增殖情況。結果：siRNA使CSE表達減少，MTT顯示實驗組明顯比對照組細胞活力有所降低，差異顯著性分別為p<0.01，p<0.05，細胞周期檢測結果顯示CSE下調明顯抑制MCF-7增殖，使細胞生長周期阻滯在s期，與對照組比較有顯著差異性。實驗結論：通過轉染siRNA的方法使乳腺癌細胞中CSE含量減少，并且CSE的下調明顯抑制了細胞的生長和增殖。

【關鍵詞】CSE? MCF-7? 乳腺癌細胞 生長增殖

一、緒論

（1）乳腺癌目前研究。目前乳腺癌前病變機理的研究，從分子水平上對癌癥的研究漸漸成為熱點。腫瘤標志物越來越成熟，可用來研究更多的新的原癌基因、抑癌基因，研究細胞凋亡基因和信號傳導基因等，來了解乳腺癌細胞治療的方法和突破點，而有利于早期的診斷、早期的預防治療和后期的復檢，方便臨床對乳腺癌進行具體分析具體分析。并且采取合理有效的措施。

（2）CSE與硫化氫。最近研究表明硫化氫由胱硫醚β合成酶（CBS），胱硫醚γ裂解酶CSE和3-巰基丙酮酸硫基轉移酶催化生成，CBS和CSE在細胞漿內生成硫化氫是以L-半胱氨酸作為底物。由此我們可以聯想到從CSE的層面，來降低硫化氫的表達量，就會對細胞的生長和增殖起到一定的作用。

二、實驗方法

（一）MCF-7細胞培養

含10 %血清的RPMI-1640培養基在37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養至對數生長期。

（二）western-blot檢測對照組和經過轉染后乳腺癌細胞中CSE表達量及相應細胞活力檢測

（1）細胞種板和轉染種六孔板，細胞密度30%-50%，第二天，每孔轉染方式如下：a將20pmolsiRNA溶于50ul1640無血清培養基中。b將1ul lip2000溶于50ul無血清1640培養基中，輕彈混勻室溫放置5min。c，將a、b兩管混合，混勻后放置20min。轉染期間，將6孔板中的培養基換成無血清培養基，每孔400ul。將c管混勻加入6孔板其中一孔中，另一個孔中加入scRNA，4-6小時換成有血清培養基。培養48h。

（2）提取蛋白和wetern-blot：分別收集處于對數生長期的對照組和轉染siRNA的MCF-7細胞;用離心機3500rpm 5min離心，棄上清;向加入1mlpbs，吹勻，移到EP管中，3000rpm 5min;將Ep管中的上清液棄去;離心管加入RIPA和PMSF（100：1）細胞裂解液， 冰上裂解30 min;裂解完后，用12000rpm，15min，4℃離心;取一部分上清進行蛋白定量，另一部分處理后進行跑膠80v30min之后轉為120v100min;總蛋白經SDS-PAGE膠電泳分離后， 轉移至PVDF膜上， 室溫下用5%脫脂牛奶封閉lh;加入一抗4 ℃過夜， 洗膜3次后， 加入二抗后室溫孵育1 h， 再洗膜3次， 經化學發光系統（Alpha， USA）檢測蛋白表達水平。β-actin為內參蛋白。

（3） MTT檢測法檢測對照組和轉染SiRNA組細胞活。收集對數生長期的MCF-7及轉染后的MCF-7細胞，接種于96孔培養板中，每孔100 μl，在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度培養箱中培養12h。待細胞貼壁后，10 μl的5 mg/ml的MTT加入每個孔中，繼續培養4 h，棄去上清液，然后加入100 μl的DMSO，慢慢搖晃，使結晶逐漸溶解。最后用酶標儀測定在570 nm波長處的吸光度值（OD值），接下來計算細胞存活率，存活率=（實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%

（三）流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期

（1）收集細胞先向種好的六孔板中每孔加入500ul0.25%的胰酶，再分別加入1ml培養基，終止消化。吹打收集入離心管。

（2）細胞的固定收集之后轉速1500r/min離心5min棄上清，用預冷的PBS洗一遍，再加入300～500 ul預冷的PBS將細胞重懸。將細胞懸液緩慢逐滴加到10 ml預冷的75%乙醇（用PBS配置）中，用手輕彈。保存到-20度，一周內檢測。

（3）細胞周期的檢測固定好之后，進行周期的檢測。取出固定好的細胞，放入離心機中，轉速1500r/min，10 min，再用預冷的PBS洗兩次，每管加入300～500的DNA染色液（現用現配），需避光放置于37度條件下染色20分鐘。最后用FACS Calibui BD流式細胞儀檢測細胞周期。

（4）統計學處理所有得到的數據采用SPSS17.0應用軟件，進行統計學分析。數據均以x?± S表示，組間差異顯著性采用t來檢驗，p﹤0.05表示組間的差異具有顯著性，p﹤0.01表示組間的差異非常顯著。

三、實驗結果

（1）兩株乳腺癌細胞MCF-7轉染CSE siRNA，作用48h。轉染后的實驗組和對照組相比，顯影結果顯示出轉染后CSE的表達量明顯減少，表明轉染后下調了CSE表達量。

（2）MTT實驗結果表明轉染siRNA的實驗組細胞存活率比對照組存活率顯著降低（p<0.01）CSE下調抑制了細胞的生長活力。

（3）CSE下調阻滯了細胞周期并抑制了乳腺癌細胞的增殖流式細胞儀檢測出的結果表明經過轉染實驗組相比于對照組，細胞周期明顯阻滯于s期，s期為細胞DNA復制合成期。下調CSE的表達量，能夠很明顯的使細胞周期阻滯在s期，即阻滯了DNA的合成，因此可以得出CSE的下調抑制了MCF-7細胞的增殖。

四、結論

MCF-7細胞轉染SiRNA后，CSE表達量降低。CSE的下調抑制了乳腺癌細胞的生長。CSE的下調使細胞周期阻滯在s期，抑制了細胞的增殖。

參考文獻：

[1]Kmnar A， Pant? MC， Singh? HS， et al. Determinants of oxidative stress and DNA damage （8-OhdG） in squamous cell carcinoma of head and neck [J].Indian J Cancer， 2012.

[2]王天曉.內源性胱硫瞇-Y一裂解酶/硫化氫調控HepG2細胞凋亡[D].開封：河南大學，2015.