鴿新城疫滅活疫苗效力評價中實驗鴿的篩選

劉云迎 刁小龍 陳堅 屠頡 何海蓉

摘要：為解決鴿新城疫滅活疫苗免疫效力評價中的標準鴿缺失問題，篩選滿足要求的試驗鴿。2019年3月對鴿場飼養管理和鴿群發病史情況進行調研，篩選合格鴿場;采血進行鴿新城疫抗體檢測，排除高母源抗體鴿群;進一步檢測鴿圓環、鴿腺病毒和鴿痘，排除感染上述易感病原鴿群;最后對選定的鴿隔離飼養一定時間，排除潛在的病原感染;采用篩選鴿進行鴿新城疫滅活苗免疫攻毒試驗，驗證是否滿足試驗的需求。通過調研，確定3家鴿場，從1月齡左右鴿群中隨機選擇50羽健康鴿進行檢測，ND母源抗體為0～1 ∶32不等，均無鴿腺病毒感染，但有個別鴿存在圓環抗體或攜帶鴿痘病毒。從其中2家鴿場購回HI抗體≤1 ∶4，且無其他病原感染風險的鴿各25羽進行鴿新城疫滅活疫苗免疫攻毒試驗，血清學檢測結果顯示，免疫組鴿免后28 d ND HI抗體在1 ∶16～1 ∶64之間，均值在1 ∶32以上;攻毒保護結果為，免疫組17/20～19/20保護，對照組均5/5發病，3～4羽死亡。通過鴿場調研初篩、新城疫HI抗體檢測、鴿常見病原檢測、隔離觀察等步驟篩選的實驗鴿可滿足鴿新城疫滅活疫苗效力評價試驗的要求，且結果穩定可靠。通過該研究篩選的實驗鴿，滿足試驗需求、提高研究結果的可靠性和重復性，并在保證鴿用疫苗質量方面具有重要意義。

關鍵詞：鴿新城疫滅活苗;效力評估;實驗鴿;篩選研究

中圖分類號： S858.91文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0177-04

收稿日期：2019-11-08

基金項目：江蘇省泰州市科技支撐計劃（農業）項目（編號：SNY20190069）。

作者簡介：劉云迎（1988—），女，山東濱州人，碩士，獸醫師，主要從事新獸藥研發與應用研究。E-mail：liuyunying@xnswkj.cn。

通信作者：何海蓉，博士，高級獸醫師，主要從事禽病診斷、疫苗研發與評價研究。E-mail：hehairong@xnswkj.cn。

實驗動物是生物制品研發、生產和檢驗的重要原材料之一，實驗動物的品質直接影響動物試驗結果。我國是實驗動物生產和使用大國，但我國自主培育的實驗動物種質資源很少，標準化與社會化程度低。目前，國際上公認的陸禽類實驗動物，只有無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雞，其他禽類如鴨、鴿、鵝等既無標準也無級別，因標準試驗動物的缺失，嚴重限制了相關預防及治療性產品的開發。

近幾年，隨著我國養鴿業的迅速發展，對鴿疾病的研究越來越多。鴿Ⅰ型副黏病毒病（Pigeon Paramyxovirus Ⅰ，PPMV-Ⅰ）俗稱鴿瘟，又稱鴿新城疫，是由鴿Ⅰ型副黏病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。各種品種、日齡鴿均可感染。該病流行期長，具有發病快、發病率和死亡率高的特點。病死率為30%～80%，嚴重時死亡率可達95%以上。近年來鴿新城疫流行病學調查顯示，我國鴿群中流行的鴿新城疫病病毒均以基因Ⅵb亞型為主。目前，市場上的新城疫疫苗主要為防控雞新城疫而開發，其與基因Ⅵb亞型的鴿新城疫病病毒遺傳距離較遠，且存在明顯的抗原差異性，因此經常出現免疫過的鴿場散發鴿新城疫的現象。為此，筆者所在課題組研究開發了Ⅵb亞型鴿新城疫滅活疫苗。研究早期在開展動物試驗時，因無標準SPF級鴿，普通鴿個體差異較大，得出的試驗數據存在偏差。因此筆者所在課題組建立了試驗鴿的篩選方法。本研究篩選的實驗鴿不僅可滿足鴿新城疫滅活疫苗效力評價試驗的要求，同時能夠提高相關研究結果的可靠性和重復性，保證鴿用疫苗產品的質量。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?實驗動物?白羽王鴿，購自江陰、如皋和高港3地某鴿場。

1.1.2?主要試劑?Ⅵb亞型鴿新城疫滅活疫苗、雞新城疫血凝抑制試驗抗原、鴿新城疫陽性血清、陰性血清和血凝抑制試驗抗原、鴿腺病毒檢測試劑盒和鴿痘檢測試劑盒，均由筆者所在實驗室制備;檢驗用毒鴿副黏病毒Pi/NT/2011株，由揚州大學分離、保存;雞新城疫標準陽性血清，購自中國獸醫藥品監察所;鴿圓環檢測試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.1.3?試驗地點?抗體及病原檢測在中崇信諾生物科技泰州有限公司研發中心實驗室進行，動物試驗在中崇信諾生物科技泰州有限公司實驗動物房進行。

1.2?方法

1.2.1?實驗鴿的篩選

1.2.1.1?初篩?對江陰鴿場、如皋鴿場及高港鴿場進行調研，實地查看鴿場飼養管理條件，同時詢問鴿場發病史、疫苗免疫史及獸藥使用情況。觀察鴿群精神狀態、采食、飲水、糞便及生長發育等是否正常。

1.2.1.2?抗體檢測?從符合初篩條件的鴿群中隨機抽取50羽1月齡左右的鴿，編號并采血，分離血清。因目前鴿場一般采用雞新城疫疫苗來預防鴿副黏感染，故采用雞新城疫血凝抑制試驗抗原測定HI抗體效價，檢測每只鴿的母源抗體水平。

1.2.1.3?易感病原的檢測?將采集的血樣按照鴿圓環病毒抗體（CV-Ab）ELISA檢測試劑盒、鴿腺病毒PCR檢測試劑盒和鴿痘病毒PCR檢測試劑盒說明書進行檢測。剔除檢測結果陽性或可疑者。

1.2.1.4?隔離觀察?篩選合格的鴿購回，隔離飼養至少1周，隔離期間每日觀察鴿精神、采食、飲水、糞便及生長發育情況。

1.2.2?鴿新城疫滅活疫苗效力試驗?取篩選的鴿25羽，20羽各胸部肌肉注射滅活疫苗0.2 mL，另5羽不免疫作為對照。接種后28日，連同對照鴿分別采血分離血清，用鴿新城疫血凝抑制試驗抗原測定HI抗體效價，同時胸部肌肉注射鴿副黏病毒Pi/NT/2011株，每羽0.2 mL（含106EID50，EID50指雞胚半數感染量）。觀察14 d，記錄各免疫組和對照組發病死亡情況。

2?結果與分析

2.1?陰性鴿的篩選情況

2.1.1?鴿場調研情況?經調研，江陰、如皋及高港鴿場的飼養管理條件較好，近2年內均未發生過細菌、病毒、寄生蟲感染，它們的種鴿在近半年內均未接種過疫苗。

2.1.2?新城疫抗體檢測結果?經檢測，鴿群ND母源抗體為0～1 ∶32不等，3家鴿場HI抗體≤1 ∶4的鴿分別占比66%、48%和58%。檢測結果顯示，在父母代鴿同一時間免疫且產蛋時間相同的情況下，所產雛鴿的母源抗體水平仍有較大差異。不同鴿場鴿母源抗體檢測情況見表1、圖1。

2.1.3?易感病原的檢測結果?按照鴿圓環病毒抗體（CV-Ab）ELISA檢測試劑盒說明書、鴿腺病毒PCR檢測試劑盒說明書和鴿痘病毒PCR檢測試劑盒說明書對采集的血樣進行檢測。結果顯示，3家鴿場均無鴿腺病毒感染，個別鴿存在鴿圓環抗體或鴿痘病毒，提示可能存在鴿圓環病毒或鴿痘病毒感染。檢測結果詳見表2。

2.1.4?隔離觀察?從江陰鴿場和高港鴿場各購回25羽HI抗體≤1 ∶4，且無其他易感病原感染的鴿，隔離觀察1周。鴿精神、采食、飲水、糞便均正常。

2.2?鴿新城疫滅活疫苗效力試驗結果

用篩選的不同來源鴿同時進行鴿新城疫滅活疫苗免疫攻毒試驗。結果顯示，免疫后28 d，免疫組各鴿新城疫HI抗體在1 ∶16～1 ∶64之間，免疫組均值在1 ∶32以上;攻毒后二免疫組各有1羽和3羽鴿出現拉稀、翅膀下垂等癥狀，其余免疫鴿精神、采食、飲水、糞便均正常，無拉稀、翅膀下垂、癱瘓等神經癥狀，17/20～19/20保護。對照組攻毒后全部發病，主要表現在羽毛蓬亂、縮頸、呆立不動、嗜睡、單側或雙側翅膀下垂、個別癱瘓、頭頸扭曲、拉黃綠色稀糞、食欲不振、個別呼吸困難。攻毒后14 d內各組3～4羽死亡。剖檢肌胃內容物呈墨綠色，腺胃黏膜、腸道黏膜出血。免疫攻毒試驗結果見表3。

3?結論與討論

實驗動物是生命科學領域研究的重要支撐條件，世界上生物醫學研究論文有50%以上是通過動物試驗獲得數據。在獸用生物制品領域，實驗動物的質量直接關系到獸用生物制品的產品質量和生物安全性。實驗動物是一種“活的試劑和度量容器”，研發課題的確立，成果水平的高低均取決于實驗動物的質量[1]。現行《中國獸藥典》附錄3501中對生產、檢驗用動物標準進行了明確規定，但未見對實驗鴿的標準和要求。近年來，我國養鴿業發展迅速，規模化養殖企業不斷增多，養鴿業已經成為繼雞、鴨、鵝之后的第四大禽類養殖產業，位居特禽養殖之首[2]。隨著養鴿業的發展，對鴿的養殖及疾病的研究越來越多。鴿新城疫是影響養鴿業發展的重要威脅之一。近幾年的流行病學調查顯示，當前鴿群中新城疫流行株為Ⅵb亞型禽Ⅰ型副黏病毒，與雞群中主要流行株的基因型不一致[3-5]，試驗也證明鴿新城疫與雞新城疫存在抗原差異性[6-7]，單純使用雞新城疫疫苗不能較好地保護鴿群免受當前鴿新城疫流行株侵襲[8]。因此，研制與當前鴿群流行株基因型一致的疫苗非常重要。目前，國內對鴿源新城疫病毒的研究主要集中在分離、鑒定、檢測方法及診斷試劑盒的研發，對疫苗的研制還較少，未見相關臨床批件或Ⅵb亞型鴿源新城疫疫苗注冊上市。為此，筆者所在課題組以Ⅵb亞型流行株為親本，利用反向遺傳技術及平臺成功構建出首個Ⅵb亞型鴿新城疫病毒致弱株，開發出鴿專用的新城疫滅活疫苗。在毒種研究、生產工藝研究及疫苗質量研究過程中，許多試驗數據均需要標準實驗動物來完成，但目前國內尚無SPF級鴿或標準的實驗動物鴿。

筆者所在實驗室在鴿新城疫滅活疫苗的研究過程中發現，鴿的品種、日齡、機體狀況、飼養環境等對試驗結果有很大影響。為了減少動物模型對試驗結果的影響，筆者所在課題組盡可能地選擇同一來源的非免鴿進行試驗。但因所需試驗鴿數量較多，小規模鴿場難以滿足需求，大規模鴿場的鴿母源抗體水平太高。而且在試驗過程中，由于飼養條件或環境的改變，鴿攜帶的病原會暴發，導致鴿發病或死亡，影響試驗結果，浪費人力、物力、財力。在目前尚無標準實驗鴿的情況下，為避免鴿體內外所攜帶的特定病原及母源抗體干擾，保證試驗結果的可重復性，筆者所在課題組基于試驗的需要，針對鴿對各種病原的易感性，建立了滿足試驗要求的實驗鴿篩選方法。

通過對鴿場進行調研，排除半年內有寄生蟲、細菌或病毒感染的鴿場，選擇眼睛炯炯有神、警惕性高，且采食、飲水、糞便及生長發育等正常的鴿群作為候選鴿群。然后從1月齡鴿群中各隨機選擇50羽鴿編號、采血并分離血清，檢測新城疫母源抗體情況，排除新城疫HI抗體高于1 ∶4的鴿子。從檢測結果來看，幼鴿新城疫母源抗體水平參差不齊，HI抗體在0～1 ∶32不等，≤1 ∶4的鴿占比50%左右，這與單達聰等的研究結果[9]一致。同時對血樣分別進行鴿圓環、鴿痘及鴿腺病毒的感染檢測，結果顯示3個鴿場均無鴿腺病毒感染，個別鴿存在鴿圓環抗體或攜帶鴿痘病毒，提示可能存在鴿圓環病毒或鴿痘病毒感染風險[10-12]。國內外流行病學調查結果顯示，由于鴿養殖的特殊性，鴿圓環感染在鴿群中普遍存在[13]。鴿感染圓環病毒后會導致免疫器官萎縮和淋巴細胞凋亡，抑制體液免疫和細胞免疫[14]，進而影響疫苗的免疫效果。因此，筆者所在課題組將抗體檢測符合要求且無鴿圓環、鴿痘及鴿腺病毒感染的鴿購回，隔離觀察1周，篩選精神、采食、飲水及糞便未見異常的鴿，用于鴿新城疫滅活疫苗效力試驗的研究。疫苗免疫后28 d，免疫組鴿HI抗體水平均有增長，且個體差異小。免后28 d攻毒，對照組均5/5發病，3/5～4/5死亡，試驗成立;免疫組17/20～19/20保護，均達質量標準，說明經初篩、新城疫抗體監測、易感病原排查、隔離飼養1周后篩選的健康鴿可滿足鴿新城疫滅活疫苗效力評價試驗的要求，能夠真實反映疫苗的免疫效果。因此，在目前無SPF級或標準實驗鴿的情況下，通過本研究對鴿進行的篩選，能夠獲得滿足實驗需求的靶動物，減少因靶動物差異對試驗結果造成的不良影響，另本研究可為SPF級鴿的培育和篩選奠定基礎。

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