多重實時熒光PCR快速檢測轉基因大豆

石盼盼 謝文佳 劉燕 王璐 陳蕾 郝莉花

摘要：采用多重實時熒光PCR技術，對大豆篩選基因35S啟動子（cauliflower mosaic virus，CaMV 35S）、NOS終止子（nopaline synthase，NOS）和內源基因Lectin設計合成了多對檢測引物和探針，在篩選各基因合適的檢測引物和探針的基礎上，摸索引物組合和擴增條件，最終確定合適的探針引物組合和試驗條件，建立轉基因大豆快速初篩技術。該方法可在1 h內同時完成對轉基因大豆3個基因片段的實時熒光PCR檢測。方法特異性強，靈敏度高，可用于大豆轉基因成分的快速檢測，大大提高檢驗效率，可為消費者的食品安全及我國大豆的進出口檢驗提供有效的技術支持。

關鍵詞：三重實時熒光聚合酶鏈式反應PCR;大豆;轉基因成分;特異性;靈敏度

中圖分類號：S565.101?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0077-04

收稿日期：2019-11-12

基金項目：河南省科技攻關計劃（編號：172102310724）。

作者簡介：石盼盼（1987—），女，河南洛陽人，碩士，工程師，主要從事食品安全質量檢測研究。E-mail：523150920@qq.com。

大豆營養豐富，為人類提供優質的蛋白質和油脂，是我國重要的糧食油料兼用作物，也是重要的飼料來源[1-2]。我國大豆及相關產品的消費量在國際上一直名列前茅。以2017年為例，我國消費大豆油1 740萬t，占全球消費總量的309%;消費豆粕7 407萬t，占全球消費總量的317%。隨著健康飲食方式的引導，大豆消費水平不斷上升，但國內種植量增長緩慢。近幾年來，我國主要從美國、阿根廷等國家進口大豆[3-4]。在進出口貿易中大豆及其產品轉基因成分是常檢項目。轉基因大豆產品因其安全性備受爭議，嚴重影響了人們對大豆的消費熱情。目前，市場監督管理及進出口檢驗檢疫部門著重于研究開發更為科學高效的轉基因大豆檢測技術，保證非批準轉基因大豆及其產品無法進入我國[5]。

我國農業農村部已經批準美國孟山都等公司的多種轉基因大豆進口到我國。我國自主研發的轉基因大豆品種也已經實現產業化。我國轉基因育種技術的發展進一步促使基因產品檢測技術的發展升級[6]。目前我國國家標準中對轉基因大豆的檢測主要以聚合酶鏈式反應（PCR）法為主。如《農業部2630號公告-15-2017轉基因植物及其產品成分檢測耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種定性PCR方法》[7]和國家標準GB/T 33526—2017《轉基因植物產品?數字PCR檢測方法》[8]。在研究領域多種基于分子生物學的檢測技術不斷涌現，但應用性方面還有待研究推廣[9-14]。其中，魏霜等利用多重串聯式PCR基因碟片技術用于轉基因大豆GTS40-3-2的檢測[15]，即利用多重PCR和巢式熒光定量PCR檢測GTS 40-3-2的多個外源基因和內源基因，實現了轉基因的高通量檢測，但該方法技術要求高，且檢測方法主要是普通PCR技術，檢測結果須要進一步凝膠電泳分析，過程相對復雜。本試驗研發的三重實時熒光PCR法可以達到多項國家標準和進出口行業標準的基因檢測限，并且1次反應能同時準確檢測有無轉基因大豆的CaMV 35S、NOS和Lectin 3個基因片斷，試驗時間短，操作簡單，方便技術推廣應用。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與試劑

大豆轉基因成分陽性質控樣品、大豆轉基因成分陰性質控樣品，均購自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心;實時熒光PCR擴增引物和探針（表1），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液（體積比為25 ∶24 ∶1）、2×PCR MasterMix，均購自北京索萊寶科技有限公司;試驗用水取自筆者所在實驗室 Milli-Q 超純水系統的二級水;其他無水乙醇等均為國產分析純試劑。

1.2?儀器與設備

Milli-Q超純水系統，購自密理博中國有限公司;HFsafe生物安全柜，購自上海力申科學儀器有限公司;LightCycle480熒光PCR儀，購自羅氏診斷產品有限公司;Colibri Titertek Berthold超微量分光光度計，購自上海科瑞生物科技有限公司;移液器，購自美國Eppendorf公司;高通量組織研磨器，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?基因組DNA的提取

酚三氯甲烷抽提法：稱取50 mg粉狀樣品至1.5 mL離心管中，加入 700 μL DNA提取裂解液，置65 ℃水浴3 h，其間不時振蕩混勻;12 000 r/min離心5 min，轉移上清至新的 1.5 mL 離心管中，加入等體積苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液（25 ∶24 ∶1），充分混勻后，12 000 r/min 離心5 min;取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液，混勻后加入2倍體積預冷的無水乙醇，-20 ℃靜置3 h，12 000 r/min離心5 min棄去上清;加70%乙醇洗滌1～2次，通風柜內室溫下晾干，加50 μL TE緩沖液，最終獲得D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間的DNA溶液。

1.3.2?引物和探針的設計

在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫查找并拷貝轉基因大豆常用外源基因CaMV 35S啟動子/NOS終止子及內源基因Lectin的序列，使用NCBI的在線引物設計功能和生工生物工程（上海）股份有限公司的引物通過在線設計軟件設計出針對這3個基因的正向引物、反向引物和熒光探針。分別使用熒光基團FAM、Cy5和HEX作為發光基團，使用TAMRA、BHQ3和TAMRA作為淬滅基團。設計的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3?引物及探針特異性測試試驗

分別用以轉基因大豆陽性質控樣品及陰性質控樣品的DNA為模板，按照以下反應體系進行反應：滅菌蒸餾水 3.4 μL、2×PCR Master Mix 10 μL、正向引物（1 μmol/L）1.8 μL、反向引物（1 μmol/L）1.8 μL，探針（0.25 μmol/L）2 μL、DNA模板（50 ng/μL）1 μL，總體系20 μL。反應程序：50 ℃預變性15 s，95 ℃預變性1 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，變性延伸過程進行45個循環。退火結束時采集探針對應的單重熒光，進行單重實時熒光PCR試驗，檢測3個基因對應的引物及探針的特異性。每個基因擴增設置陽性樣品、陰性樣品、空白對照，各設2個重復。陽性試驗以轉基因大豆陽性質控樣品DNA為模板，陰性試驗以轉基因大豆陰性質控樣品DNA為模板，空白對照以無菌水作為擴增模板。

1.3.4?三重熒光PCR反應體系及程序

在各基因單重PCR檢測對應引物探針特異性良好的基礎上，摸索合適的引物配比和試驗條件，進行三重實時熒光PCR試驗，最終三重熒光PCR檢測體系見表2，擴增程序優化結果如下：95 ℃預變性15 s;95 ℃ 變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，變性延伸過程進行45個循環。退火結束時采集探針對應的三重熒光即FAM、HEX和CY5采集信號，每個基因擴增設置陽性樣品、陰性樣品、空白對照，各設2個重復。陽性試驗以轉基因大豆陽性質控樣品DNA為模板，陰性試驗以轉基因大豆陰性質控樣品DNA為模板，空白對照以無菌水為擴增模板。

1.3.5?三重熒光PCR檢測體系的靈敏度試驗

將轉基因大豆陽性質控樣品和轉基因陰性玉米樣品以質量1 ∶9混合均勻，以“1.3.1”節的方法提取DNA， 再10倍逐級稀釋使陽性DNA占1%、0.1%。然后以大豆轉基因陽性質控樣品DNA和陽性占比為10%、1%、0.1%的質控樣品DNA為模板，按“13.5”節三重熒光PCR反應體系及程序進行PCR擴增，每個模板設置2個重復，觀察擴增情況，記錄各DNA的擴增循環數（CT）。

2?結果與分析

2.1?引物探針特異性檢測結果

2.1.1?CaMV 35S基因擴增用引物和探針特異性檢測結果

如圖1所示，只有以轉基因大豆陽性質控樣品DNA為模板時才有特異性擴增，2個平行樣品的CT值為分別為23.61、24.55，而其他樣品DNA沒有擴增。說明設計合成的大豆轉基因CaMV35S啟動子檢測用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應。

2.1.2?大豆內源Lectin基因擴增用引物和探針特異性檢測結果

如圖2所示，當以轉基因大豆陽性質控樣品和陰性質控樣DNA為模板時才有特異性擴增，2個平行樣品的CT值分別為23.61、24.55和27.03、26.69。而非大豆樣品DNA和空白對照DNA均沒有擴增。說明設計合成的大豆內源基因Lectin檢測用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應。

2.1.3?NOS終止子基因擴增用引物和探針特異性檢測結果

如圖3所示，只有以轉基因大豆陽性質控樣品DNA為模板時才有特異性擴增，CT值分別為28.14、28.02，而其他樣品DNA沒有擴增。說明設計合成的大豆轉基因NOS終止子檢測用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應。

2.2?三重實時熒光PCR體系擴增圖結果

如圖4、圖5、圖6所示，三重體系中陽性樣品各基因均有典型的“S”形擴增，陰性樣品除Lectin基因外其余都沒有擴增，試劑空白和提取過程空白均沒有擴增。說明建立的三重PCR體系擴增特異性良好，體系成立。

2.3?多重PCR體系的靈敏度測定

由圖7、圖8、圖9、表3可知，構建的三重擴增體系中CaMV 35S基因、Lectin基因和NOS的檢測靈敏度均可以達到樣品質量濃度的0.1%。

3?結論

本研究利用多重熒光PCR的優勢，建立了可同時檢測轉基因大豆啟動子35S、終止子NOS和內源基因Lectin的三重實時熒光PCR方法，可以通過1次PCR實現對大豆樣品的轉基因初級篩查。特異性和靈敏度檢測證明該方法可用于大豆樣品的轉基因檢測，大大提高了檢測效率，操作過程簡單宜于推廣，對進一步促進分子生物學技術在檢驗檢測領域的應用有一定的推動作用。但該方法中NOS在三重體系中顯示檢測熒光值偏低，可能與CY5熒光值較弱有關，該體系也有待進一步優化，在不同品牌PCR儀間的適用性問題也有待進一步驗證。

參考文獻：

[1]郝景波. 大豆微量成分的特殊營養價值[J]. 黑龍江糧食，2015（9）：51-53.

[2]荊常亮，周金輝，張成省，等. 野生大豆營養成分及生物活性因子的研究進展[J]. 大豆科學，2019，38（4）：644-649.

[3]王雪琴. 中國大豆進口依存度影響因素及對策研究[D]. 武漢：武漢輕工大學，2018.

[4]鄭金英，翁?欣. 國際轉基因大豆對中國大豆產業及其期貨市場的影響[J]. 亞太經濟，2015（5）：39-46.

[5]王宇紅. 我國轉基因食品安全政府規制研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2012.

[6]康宇立，朱?濤，麻曉春. 中美轉基因生物安全監管體系對比[J]. 生命世界，2018（9）：6-7.

[7]中華人民共和國農業部.農業部2630號公告-15-2017轉基因植物及其產品成分檢測?耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2017.

[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫局.轉基因植物產品?數字PCR檢測方法：GB/T 33526—2017[S]. 北京：中國標準出版社，2017.

[9]孟?靜，孫瀟慧，鐘立霞，等. 豆制品中轉基因成分檢測的研究進展[J]. 大豆科學，2019，38（1）：148-152.

[10]閆?偉，龍麗坤，李蔥蔥，等. 三種轉基因大豆品系的多重熒光PCR檢測體系建立[J]. 大豆科學，2019，38（5）：712-718.

[11]竇?雯，李?尤，逯欣宇，等. 轉基因大豆RPA檢測技術的建立及應用[J]. 生物技術通報，2019，35（5）：170-175.

[12]Kamle M，Kumar P，Patra J K，et al.Current perspectives on genetically modified crops and detection methods[J]. 3 Biotech，2017，7（3）：219.

[13]Xu C，Li L，Jin W J，et al. Recombinase polymerase amplification （RPA） of CaMV-35S promoter and nos terminator for rapid detection of genetically modified crops[J]. International Journal of Molecular Science，2014，15（10）：18197-18205.

[14]祖?新，徐軼飛，李羽翡，等. 可視化膜芯片檢測轉基因大豆的研究[J]. 食品安全質量檢測學報，2019，10（11）：3488-3492.

[15]魏?霜，周廣彪，劉?津，等. 多重串聯式PCR基因碟片技術檢測轉基因大豆GTS 40-3-2[J]. 中國食品學報，2018，18（2）：244-249.