金蓮花不同溶劑提取物抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的譜-效關系研究

南敏倫 孫琦 楊振 司學玲 馬春霞 白雪 赫玉芳

摘 要 目的：研究金蓮花11種不同溶劑提取物抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的譜-效關系。方法：利用高效液相色譜-串聯質譜法建立金蓮花11種不同溶劑提取物的指紋圖譜，通過與對照品、文獻信息比對，指認共有峰對應的化合物。采用MTT法檢測金蓮花11種不同溶劑提取物對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞H9c2存活率的影響，采用酶聯免疫吸附測定法檢測細胞中丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）水平和上清液中乳酸脫氫酶（LDH）含量。通過灰色關聯度分析法（GRA）和偏最小二乘法（PLS）聯合分析共有峰對應成分與抗心肌細胞缺氧/復氧損傷（藥效）的譜-效關系。結果：金蓮花11種不同溶劑提取物的指紋圖譜中有22個共有峰，指認出22個化合物。與缺氧/復氧損傷組比較，缺氧/復氧+S1～S6、S9、S10組細胞的存活率均顯著升高，MDA含量、ROS水平、LDH含量均顯著降低（P<0.05）;缺氧/復氧+S8組細胞的ROS水平、LDH含量均顯著降低（P<0.05）。22個化合物與藥效的GRA關聯度均大于0.8;除峰1、2、7、13、14、21外，其余峰對應化合物與藥效的PLS分析回歸系數均大于0（即成正相關）;貢獻排名前9位的共有峰均為峰6>11>4>5>8>9>12>10>15。結論：葒草苷（峰6）、牡荊苷（峰11）、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰4）、葒草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰5）、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（峰8）、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰9）、金絲桃苷（峰12）、牡荊素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰10）、2″-O-（2[″][′]-甲基丁酰基）-葒草苷（峰15）可能是金蓮花抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的主要成分。

關鍵詞 金蓮花;心肌細胞H9c2;缺氧/復氧損傷;譜-效關系;灰色關聯度分析法;偏最小二乘法

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）18-2219-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.08

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study spectrum-effect relationship of 11 different solvent extracts from Trollius chinensis against hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocyte. METHODS： HPLC-MS/MS method was used to establish the fingerprints of 11 different solvent extracts from T. chinensis， the compounds corresponding to the common peaks were identified by comparing with the substance control and literature information. MTT assay was used to detect the effects of 11 different solvent extracts from T. chinensis on the survival rate of rat myocardial H9c2 cells injured by hypoxia/reoxygenation. The MDA content， ROS level in cells and LDH content in the supernatant were detected by ELISA. GRA and PLS method were used to analyze the spectrum-effect relationship between the compounds corresponding to common peak and anti-hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocyte （drug effect）. RESULTS： There were 22 common peaks in 11 different solvent extracts from T. chinensis， and 22 compounds were identified. Compared with hypoxia/reoxygenation injury group， survival rate of hypoxia/reoxygenation injury+S1-S6，S9 and S10 groups were increased significantly， while MDA content， ROS level and LDH content were decreased significantly （P<0.05）; ROS level and LDH content of hypoxia/reoxygenation injury+S8 group were decreased significantly （P<0.05）. The r of GRA analysis of 22 compounds with drug effects were all higher than 0.8. Except for peaks 1， 2， 7， 13， 14 and 21， r of PLS analysis of rest peaks with drug effects were higher than 0（being positive correlation）. Top 9 common peaks in the list of contribution rate were peak 6>11>4>5>8>9>12>10>15. CONCLUSIONS： Orientin （peak 6），vitexin （peak 11）， orientin-2″-O-β-L-galacto- pyranosl （peak 4）， orientin-2″-O-β-D-Pyrine xylosides （peak 5）， quercetin-3-O-glucopyranoside （peak 8）， vitexin-2″-O-β-L-galactoside （peak 9）， hyperoside （peak 12）， vitexin-2″-O-β-D-pyrine xylosides （peak 10）， 2″-O-（2[″][′]- methylbutyry-loxy）-orientin （peak 15） may be the main components of anti-hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocytes.

2.1.6 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”“2.1.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，以葒草苷峰（峰6）為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.22%（n=6），相對峰面積的RSD均小于1.33%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取金蓮花藥材粉末100 mg，共6份，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液（編號：S3），再按“2.1.1”“2.1.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，以葒草苷峰（峰6）為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.38%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.02%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.8 指紋圖譜生成及特征峰確認 按“2.1.3”項下方法制備金蓮花11種提取物的供試品溶液，再按“2.1.1”“2.1.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，設置時間窗寬度為0.1 min，圖譜間距為20 mV，通過多點校正及自動匹配生成金蓮花11種提取物的疊加指紋圖譜，結果見圖1。由于S3圖譜吸收信號較強、峰形明顯、穩定性較好，故選擇S3樣品的圖譜作為參照圖譜。依據各色譜峰的準分子離子峰及二級質譜碎片信息，通過與對照品、文獻信息[3，7-13]比對，指認金蓮花中共有峰對應的化學成分。結果，金蓮花11種提取物指紋圖譜中有共有峰22個，化學成分的指認結果見表1。

2.2 金蓮花提取物對H9c2細胞缺氧/復氧損傷的保護作用

2.2.1 細胞培養 將H9c2細胞放置在培養箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、5%CO2條件下培養，每2 d更換1次培養基，待細胞生長至80%～90%時進行傳代，并取對數生長期的細胞進行后續試驗。

2.2.2 分組與處理 將對數生長期的H9c2細胞分為13組，分別為正常對照組、缺氧/復氧組、缺氧/復氧+各提取物（S1～S11）組。正常對照組細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、5%CO2條件下培養3 h;缺氧/復氧組細胞用無糖、無血清的DMEM培養基于37 ℃、5%CO2、95%N2條件下培養3 h后，再按正常對照組條件培養3 h;缺氧/復氧+各提取物組細胞先分別用0.1 ?g/L（按預試驗結果設置，以提取物質量計）的S1～S11預處理30 min后，再按照缺氧/復氧組條件培養。

2.2.3 H9c2細胞存活率檢測 采用MTT法檢測。將H9c2細胞按5×103個/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，按“2.2.2”項下方法分組、處理后，分別加入MTT試劑100 μL，于37 ℃條件下繼續培養4 h，棄上清液，加入DMSO 100 μL，振蕩反應10 min，用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值，以不含細胞的空白培養基作為空白組，計算細胞存活率：細胞存活率=（試驗組OD值/空白組OD值）×100%。每組設6個復孔，試驗重復3次。

2.2.4 H9c2細胞中MDA含量、ROS水平和上清液中LDH含量檢測 采用ELISA法檢測。將H9c2細胞按5×103個/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，按“2.2.2”項下方法分組、處理后，按試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔OD值，計算細胞中MDA含量和ROS水平以及上清液中LDH含量。試驗重復3次。

2.2.5 數據處理及結果分析 使用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。各組細胞的存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量的檢測結果見表2。

由表2可見，與正常對照組比較，缺氧/復氧組細胞的存活率顯著降低，MDA含量、ROS水平、LDH含量均顯著升高（P<0.05）;與缺氧/復氧組比較，除缺氧/復氧+S7組、缺氧/復氧+S8組、缺氧/復氧+S11組外其余各組細胞的存活率均顯著升高，MDA含量均顯著降低（P<0.05）;除缺氧/復氧+S7組、缺氧/復氧+S11組外其余各組細胞的ROS水平、LDH含量均顯著降低（P<0.05）。

2.3 金蓮花化學成分與抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的譜-效分析

2.3.1 GRA 利用DPS-3.01軟件，根據細胞存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量計算金蓮花抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的綜合活性數據，加權系數均為0.25。將共有峰峰面積數據與綜合活性數據進行關聯，通過對原始數據進行標準化轉化處理后，計算關聯度并排序，以評估各共有峰對藥效的貢獻，結果見表3。由表3可見，22個共有峰所對應的化學成分與藥效的關聯度均大于0.8，貢獻排名前9位的共有峰依次為峰6>11>4>5>8>9>12>10>15。

2.3.2 PLS分析 利用SIMCA-11軟件，經過多次提取主成分、多次迭代后，擬合出22個共有峰所對應的化學成分對抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的重要程度（即標準化回歸系數）并排序，結果見表4。

3 討論

據文獻報道，譜-效關系的統計學分析有多種方法，如相關分析法、GRA法、聚類分析法及PLS法[5]。本文應用了GRA法和PLS法聯合分析了金銀花11種不同溶劑提取物中22個共有峰對應成分與抗心肌細胞缺氧/復氧損傷（藥效）的譜-效關系。GRA法主要分析兩種因素在發展過程中的關聯度大小，但其只能單獨考察各成分的重要性，并不能反映各成分對藥效的綜合作用[6-7]，故本文又采用了PLS法，通過擬合藥效與色譜峰之間的相關性，分析各成分對藥效的重要程度[14-15]。

據文獻報道，金蓮花中主要成分是黃酮類成分，此外還有少量的揮發油、生物堿、有機酸、多糖、醇類、苷類等多種成分[9]。由于化學成分的多樣性，提取方法也較多，常用的提取方法有微波提取法、回流提取法、超聲提取法和超臨界流體提取法等[16-17]，回流提取能盡可能得提取有效成分[13]，故本研究選擇了回流提取法。此外，不同溶劑對不同類化學成分的溶解性不同，如揮發油易溶解于石油醚中，生物堿、醇類易溶解于三氯甲烷中，黃酮易溶解于高濃度乙醇或乙酸乙酯中，黃酮苷易溶解于低濃度乙醇或正丁醇中，多糖易溶解于水中，故為了盡可能地將各類成分均提取出來，本文選擇了“2.1.3”項下的提取方法，并得到了11種提取物。

本研究初步評價了金蓮花90%、80%、70%、60%、50%乙醇提取物以及石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃提取物對心肌細胞缺氧/復氧損傷的主要指標細胞存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量的影響。研究結果表明，其中不同體積分數乙醇提取物以及乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物對各指標的影響較為顯著。

本研究分析鑒定了金蓮花11種提取物中22個化學成分，通過譜-效分析確定了其中對心肌細胞缺氧/復氧損傷起保護作用的主要化學成分可能為峰6、11、4、5、8、9、12、10、15，即葒草苷、牡荊苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷、金絲桃苷、牡荊素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷、2″-O-（2[″][′]-甲基丁酰基）-葒草苷，主要為黃酮類化合物，提示金蓮花的抗心肌細胞缺氧/復氧損傷作用可能與上述成分相關。有文獻報道，葒草苷、牡荊苷等黃酮類成分為金蓮花的主要活性成分[12]，且上述成分均有一定的抗心肌缺血作用[4]，進一步論證了本研究的可靠性。這對于闡明金蓮花抗心肌缺血的藥效物質基礎研究、金蓮花及其提取物多指標質量控制標準的建立具有積極意義。

綜上所述，葒草苷（峰6）、牡荊苷（峰11）、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰4）、葒草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰5）、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（峰8）、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰9）、金絲桃苷（峰12）、牡荊素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰10）、2″-O-（2[″][′]-甲基丁酰基）-葒草苷（峰15）可能是金蓮花抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的主要成分。

參考文獻

[ 1 ] 趙學敏.本草綱目拾遺[M].北京：人民衛生出版社，1983：256.

[ 2 ] 南敏倫，趙昱瑋，司學玲，等.不同采收期金蓮花中三種碳苷黃酮成分動態變化研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（4）：118-120.

[ 3 ] 宋冬梅，孫啟時. 金蓮花屬植物研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2005，22（3）：232-234.

[ 4 ] 趙全成，南敏倫，赫玉芳，等.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷及組合物在制備抗心肌缺血藥物中的應用：中國，CN101559066 A[P].2009-10-21.

[ 5 ] 劉英，徐永莉，李力.中藥譜效關系研究思路與應用概況[J].時珍國醫國藥，2018，29（3）：677-680.

[ 6 ] 鄭林，李靖，陳慧，等.葒草對H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷保護作用的譜效關系研究[J].中國中藥雜志，2012，37（17）：2585-2588.

[ 7 ] 劉智，王麗，李雯，等. HPLC測定金蓮花制劑中葒草苷和牡荊苷的含量[J].中國中藥雜志，2004，29（11）：1049-1051.

[ 8 ] 張怡，耿敘武.金蓮花片質量標準研究[J]. 黑龍江醫藥，2002，16（6）：423-424.

[ 9 ] 任正博，張振學，周偉利，等.金蓮花化學成分研究[J].中國現代中藥，2006，8（2）：14-15.

[10] 彭玉帥，劉莉嘉，趙燦，等.金蓮花中首次分離的1個酚酸類化合物及其抗炎和抑菌活性[J].中華中醫藥學刊，2015，33（6）：1349-1351.

[11] 白云娥，漆小梅，高品一，等.金蓮花水-醇提取工藝比較[J].中成藥，2007，29（10）：1521-1523.

[12] 王如峰，賡迪，吳秀穩，等.金蓮花中4種主要成分的抗炎活性研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（9）：2115-2116.

[13] 王如峰，賡迪，吳秀穩，等. RP-HPLC法同時測定金蓮花中5種黃酮苷類成分的含量性[J].沈陽藥科大學學報，2018，35（1）：47-52.

[14] 李力，潘倩雯，劉宏.灰色關聯度分析法在中藥譜效學研究中的應用[J].中國藥房，2018，29（11）：1581-1584.

[15] 林夢雅，張玉萍，李雅，等.基于灰色關聯度分析的丹參提取物抗炎作用譜效關系研究[J].中草藥，2017，48（16）：3447-3452.

[16] 劉曉燕，蔣益萍，張嘉寶，等.啤酒花的HPLC指紋圖譜建立及其抗氧化作用譜效關系研究[J].中國藥房，2020，31（2）：138-143.

[17] 賈富霞，羅容，王秀娟.譜效關系研究方法在中藥研究中的應用進展[J].北京中醫藥，2015，34（12）：996-1000.

（收稿日期：2020-05-07 修回日期：2020-06-17）

（編輯：鄒麗娟）