加味柴芍六君顆粒對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療效果及對結(jié)腸組織髓樣分化因子88表達(dá)的影響▲

王 偉 李桂賢 蘇 攀 徐 晴 鄭超偉 李 敏 文亦磊

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，南寧市 530023，電子郵箱：wangweizx@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530001)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC) 是一種原因尚不明確的慢性非特異性炎癥性腸病，臨床表現(xiàn)主要有腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重，或發(fā)熱、便秘、體重減輕、貧血等全身癥狀，病情輕重不等，病程遷延并反復(fù)發(fā)作[1]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的表達(dá)水平對判斷UC的嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要意義[2]。本病屬于中醫(yī)學(xué)的“泄瀉”“痢疾”“腸澼”“休息痢”等范疇。加味柴芍六君顆粒是全國名老中醫(yī)李桂賢教授的驗(yàn)方，具有疏肝健脾、活血化瘀、清熱止瀉、理氣止痛的功效，是治療UC的較好方法。本課題組前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，加味柴芍六君顆粒具有很好的調(diào)節(jié)免疫功能作用，且可緩解UC患者的臨床癥狀，療效顯著[3-5]。在此基礎(chǔ)上,本研究分析不同劑量加味柴芍六君顆粒治療UC的效果及其基于MyD88通路改善UC模型大鼠免疫失衡情況的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，雌雄各半，體重為150～250 g，5～6周齡，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持(23±2)℃，恒濕(52%～65%)，光照黑暗交替12 h，混合飼料喂養(yǎng)，自由飲水。新西蘭大白兔4只，雌雄不限，體重(2.5±0.2)kg，6～7周齡為主。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2009-0002)。

1.2 藥物 (1)加味柴芍六君顆粒組成：柴胡10 g，陳皮6 g，茯苓15 g，白芍15 g，半夏10 g，炒白術(shù)15 g，太子參15 g，三七10 g，鳳尾草20 g，白花蛇舌草20 g，甘草6 g。采用免煎顆粒配方，以上免煎中藥均購自江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎中藥(批號：1209082)。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科分別配制成濃度為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的加味柴芍六君顆粒溶液。(2)柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine,SASP)由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)(規(guī)格為250 mg/片，批號：20070312)，粉碎過篩，用濃縮甲基纖維素鈉配制成67.5 mg/mL的混懸液。以上藥液配好后裝瓶，4℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 MyD88抗體購自美國Abcam公司(批號：ab131071)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz公司購自美國Abcam公司(批號：ab7090)，二喹啉甲酸蛋白濃度檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(批號：P0012S)，PageRulerTMPrestained Protein Ladder 購自Fermentas公司(批號：SM0671)，BeyoECL Plus超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司(批號：P0018)。

1.4 主要儀器 冷凍高速離心機(jī)(型號：TGL-18R)、高速組織勻漿儀(型號：FSH-2A)、可見紫外分光光度計(jì)(型號：Aipha1900)、包埋機(jī)(型號：TB-718D)、攤片機(jī)(型號：HS-1125)、烘箱(型號：BJYSL-DHG-9023A)均購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。TS-1脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，AX-Ⅱ X射線攝影暗匣(127 mm×178 mm)購自廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司，AF100制冰機(jī)購自Scotsman公司，TGL-18R冷凍高速離心機(jī)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，DK-8D電熱恒溫水槽購自上海一恒科技有限公司，QL-901旋渦振蕩器購自海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，550型酶標(biāo)儀購自日本Advance公司，CK1000組織研磨儀購自Thmorgan公司，磁力攪拌器購自常州澳華儀器有限公司，DK-8D電熱恒溫水槽購自上海一恒科技有限公司。

1.5 建立UC模型 采用隨機(jī)數(shù)字表將60只大鼠分為正常組、模型組、SASP組以及中藥大、中、小劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組均建立UC模型。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]的方法，采用免疫法制備大鼠UC模型：(1)取新西蘭大白兔結(jié)腸(距肛門10 cm至橫結(jié)腸處)黏膜，與完全福氏佐劑制成抗原乳化液；(2)造模前大鼠禁食24 h，可飲水，于第1、10、17、24、31 天分別在大鼠足跖趾內(nèi)、后腿內(nèi)側(cè)皮下、背部皮下、腹股溝、腹腔內(nèi)各注射抗原1 mL。造模期間，每日觀察大鼠大便、活動(dòng)等狀況，每3 d測1次糞便潛血，造模時(shí)間共40 d。造模結(jié)束后，每組按隨機(jī)數(shù)字表法抽取2只大鼠，腹腔注射25%烏拉坦6 mL/kg進(jìn)行麻醉后剖取結(jié)腸做病理檢查，確認(rèn)存在結(jié)腸充血出血、水腫、小潰瘍形成、炎細(xì)胞浸潤、腺體破壞等病理變化，則造模成功。

1.6 給藥方法 造模成功后，立即給予正常組及模型組3 mL生理鹽水灌胃；SASP組給予SASP混懸液0.3 g/kg灌胃；中藥大、中、小劑量組分別給予濃度為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL的加味柴芍六君顆粒溶液3 mL灌胃。各組均給藥1次/d，連續(xù)治療4周。

1.7 標(biāo)本采集及處理 各組大鼠給藥4周后，立即給予腹腔注射25%烏拉坦6 mL/kg進(jìn)行麻醉，斷頭處死。打開腹腔，從肛門以上分離結(jié)腸，截取自肛門向上10 cm的結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剪開，用冰生理鹽水反復(fù)沖洗結(jié)腸組織，去除結(jié)腸黏膜表面黏附的糞便、分泌物及血液。在濾紙上將腸黏膜面向上展開，肉眼觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)并評分。然后以病灶為中心(除正常組外)縱軸切開，分為兩部分：一部分組織以40 g/L甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后，進(jìn)行病理組織切片觀察；另一部分組織經(jīng)濾紙吸干后稱重，置于-70℃冰箱凍存待測。

1.8 觀察指標(biāo)

1.8.1 大鼠一般情況和結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評估：自造模后每天觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)狀態(tài)、進(jìn)食量、飲水量等一般情況。處死大鼠后，肉眼觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)，評價(jià)結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colon mucosa damage index,CMDI)[7]，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。將結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色后，光鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織。

表1 CSMDI評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.8.2 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)：取大鼠結(jié)腸組織約1 cm，共3小塊，用4%多聚甲醛固定30～60 min，磷酸緩沖鹽溶液洗2次(2 min/次)，5℃下進(jìn)行組織脫水，常規(guī)石蠟包埋，組織切片，厚度4 μm，然后將切片置于載玻片上，并做黏附處理。常規(guī)脫蠟至水，3% 過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，切片侵入0.01 mol/L枸櫞酸鹽熱修復(fù)抗原，滴加5%牛血清白蛋白封閉液封閉20 min。滴加一抗(MyD88抗體，稀釋比1 ∶10)37℃標(biāo)記1 h，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2～3次。滴加山羊抗小鼠IgG-HRP，20℃～37℃反應(yīng)20 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌4次(5 min/次)，二氨基聯(lián)苯胺顯色。蒸餾水洗，脫水、透明、樹脂膠封片，顯微鏡觀測結(jié)果。細(xì)胞中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞表達(dá)。以上步驟均由專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用Image-Pro圖像分析系統(tǒng)測定光學(xué)顯微鏡下所拍圖像中MyD88蛋白陽性區(qū)的灰度，進(jìn)行半定量分析。

1.8.3 蛋白免疫印記法檢測大鼠腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)：取大鼠結(jié)腸組織剪碎，加入約300 U全細(xì)胞蛋白裂解液(50 mmol/L Tris-HCL+50 mmol/L氯化鈉+1% NP-40裂解液+1 μmmol/L苯甲基磺酰氟+50 HM亮抑蛋白酶肽+100 μmmol/L胰蛋白酶抑制劑溶液),充分裂解結(jié)腸組織后，12 000 g離心3～5 min，取上清液，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量的測定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。每孔上樣20 μg總蛋白，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜，即聚偏二氟己烯膜4℃過夜，加入一抗MyD88抗體(1 ∶1 000 Tris-HCL緩沖鹽溶液稀釋)室溫孵育2 h，加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，濃度為1 ∶4 000)室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光顯色。顯影和定影，掃描蛋白印跡條帶。用小型全套蛋白電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)分析各條帶的灰度值，并計(jì)算各組MyD88的平均灰度比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用PEMS 3.2及SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多個(gè)樣本間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，若方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況 模型造模過程中，正常組大鼠食量正常，精神狀態(tài)可，毛發(fā)有光澤無脫落，活動(dòng)正常，大便正常，無黏液膿血便；模型組及各藥物干預(yù)組大鼠食量逐漸減少，體重逐漸減輕，精神狀態(tài)逐漸變差，毛發(fā)逐漸晦暗少光澤和疏松粗糙，活動(dòng)逐漸變少，大便開始出現(xiàn)溏爛，逐漸出現(xiàn)黏液膿血便；但經(jīng)藥物干預(yù)后，各藥物干預(yù)組大鼠體重逐漸增加，食量逐漸增加，精神變好，黏液膿血便逐漸消失，大便基本成形。

2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變

2.2.1 肉眼觀察：正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織腸道無縮短，腸壁黏膜光滑，紋理清晰，腸壁厚度均勻，未見水腫、糜爛及潰瘍；模型組大鼠病變結(jié)腸黏膜表面可見潰瘍，個(gè)別深達(dá)肌層，炎癥反應(yīng)較重，有充血、糜爛；與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠的結(jié)腸黏膜組織病變均有不同程度減輕；而與SASP組比較，各劑量中藥組大鼠結(jié)腸黏膜的出血點(diǎn)、充血、水腫、糜爛、潰瘍數(shù)目均有所減少。正常組CMDI評分均低于其余5組(均P<0.05)；各藥物干預(yù)組CMDI評分均低于模型組(均P<0.05)；中藥中劑量組CMDI評分均低于其他藥物干預(yù)組(均P<0.05)，而其他藥物干預(yù)組之間的CMDI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

2.2.2 光鏡下觀察：正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織基本完整無缺損，上皮細(xì)胞排列整齊連續(xù)，基本無炎癥細(xì)胞浸潤，腺體結(jié)構(gòu)清楚、分泌活躍、分布規(guī)則，黏膜層、黏膜下次、肌層、漿膜層無異常；模型組大鼠結(jié)腸黏膜表面潰瘍形成，少數(shù)深達(dá)肌層，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞及腺體部分缺失，黏膜及黏膜下層明顯水腫，杯狀細(xì)胞減少，間質(zhì)隱窩、腸腺及間質(zhì)可見大量急慢性炎癥細(xì)胞浸潤；各藥物干預(yù)組大鼠結(jié)腸黏膜周圍上皮增生修復(fù)，杯狀細(xì)胞豐富，基本恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，腺體分泌可，黏膜固有層可見少量細(xì)胞浸潤，其中中藥中劑量組黏膜缺損較表淺，修復(fù)好。見圖1。

表2 6組大鼠結(jié)腸黏膜CMDI比較(x±s，分)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與中藥中劑量組比較，▲P<0.05。

圖1 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)改變(HE染色，400×)

2.3 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)水平免疫組化檢測結(jié)果比較 免疫組化檢測結(jié)果顯示，MyD88陽性表達(dá)染色呈棕黃色，見于結(jié)腸黏膜表面、下層及固有層細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中。正常組MyD88蛋白表達(dá)水平均低于其余5組(均P<0.05)；各藥物干預(yù)組MyD88蛋白相對表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05)；中藥小劑量組、中藥大劑量組、SASP組、中藥中劑量組MyD88蛋白對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表3及圖2。

表3 6組MyD88蛋白表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果比較(x±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05； 與中藥小劑量組比較，▲P<0.05；與中藥中劑量組比較，★P<0.05；與中藥大劑量組比較，●P<0.05。

圖2 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織MyD88的表達(dá)(ECL染色，400×)

2.4 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)水平蛋白免疫印記法檢測結(jié)果比較 正常組MyD88蛋白相對表達(dá)水平均低于其余5組(均P<0.05)；各藥物干預(yù)組MyD88蛋白相對表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05)；中藥小劑量組、中藥大劑量組、SASP組、中藥中劑量組MyD88蛋白對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表4及圖3。

表4 6組MyD88蛋白表達(dá)水平蛋白免疫印記法檢測結(jié)果比較(x±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與中藥小劑量組比較，▲P<0.05；與中藥中劑量組比較，P<0.05；與中藥大劑量組比較，●P<0.05。

圖3 6組凝膠電泳圖

3 討 論

相對于化學(xué)藥物的單一靶點(diǎn)治療作用,中藥復(fù)方成分復(fù)雜,針對病癥具有多組分、多靶點(diǎn)、多通路的整體治療作用[8-10]。在多病因的復(fù)雜慢性疾病治療中，中藥具有西藥無法比擬的巨大優(yōu)勢和良好前景。中醫(yī)藥分期、分型辨證治療UC，多以自擬方、經(jīng)驗(yàn)方為主，臨床療效顯著，優(yōu)點(diǎn)突出。加味柴芍六君顆粒是全國名老中醫(yī)李桂賢教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，對UC的治療具有較好的臨床療效。柴芍六君湯出自《醫(yī)宗金鑒》，該方具有較好的疏肝健脾功效。該方實(shí)為四逆散和六君子湯化裁而成，取兩者合用以疏肝健脾，并加入白花蛇舌草、鳳尾草清熱利濕止瀉，三七活血祛瘀，陳皮行氣止痛，寓“行血?jiǎng)t便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”之意，同為佐使藥，甘草調(diào)和諸藥為使藥，諸藥合用，共奏疏肝解郁、理氣健脾、清熱利濕止瀉、活血祛瘀之功。本研究結(jié)果顯示，模型組及各藥物組大鼠的結(jié)腸黏膜均出現(xiàn)不同程度的炎癥性腸病病理變化，且CMDI評分均高于正常組(P<0.05)；而經(jīng)干預(yù)后，中藥各劑量組大鼠胃腸道癥狀減輕，其腸黏膜的病理變化亦輕于模型組，且CMDI評分均低于模型組(均P<0.05) 。這提示加味柴芍六君顆粒對UC有較好的療效。此外，中藥中劑量組的CMDI評分低于其他藥物組(P<0.05)，提示對于UC大鼠，濃度為0.5 mg/mL的加味柴芍六君顆粒或具有更好的療效，增加用藥劑量可能并不能提高療效。

研究表明，免疫調(diào)節(jié)異常參與了UC的發(fā)病[11]。目前較被認(rèn)可的觀點(diǎn)是，UC是一種非典型的Th2型免疫反應(yīng)異常的疾病[12]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)主要分布在具有先天性免疫功能的細(xì)胞上，如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞，是重要的介導(dǎo)腸黏膜先天防御反應(yīng)的介質(zhì)，在維持腸黏膜和腸道微生態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。在病理狀態(tài)下，異常的TLR信號通路可能刺激不同的免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致各種急慢性炎癥[13]。已有研究表明，MyD88是TLR信號通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，是信號向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵靶分子，在傳遞上游信息和炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[14-16]。MyD88介導(dǎo)的TLR4/MyD88/核因子κB信號通路在UC致病過程中具有關(guān)鍵作用，阻斷其中任一環(huán)節(jié)的作用,將減弱炎癥反應(yīng)，從而起到臨床治療作用[17]。本研究免疫組化及蛋白免疫印跡檢測結(jié)果均顯示，模型組腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)水平均高于正常組(均P<0.05)，這提示MyD88蛋白高表達(dá)與UC的發(fā)病密切相關(guān)；中藥大、中、小劑量組的MyD88蛋白表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)，且中藥小劑量組、中藥大劑量組、SASP組、中藥中劑量組MyD88蛋白對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)，這提示加味柴芍六君顆粒或通過下調(diào)MyD88蛋白表達(dá)而減輕免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療UC的作用，其中中劑量的加味柴芍六君顆粒作用效果更好。

綜上所述， 加味柴芍六君顆粒可改善UC大鼠的癥狀及結(jié)腸黏膜病理變化，以中劑量效果最佳；其或通過降低MyD88蛋白水平，進(jìn)而阻斷脂多糖TLR4/MyD88/核因子κB信號通路的異常傳導(dǎo)，抑制TLR4/MyD88/核因子κB通路之間的串流，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)，提高其免疫耐受,促進(jìn)結(jié)腸黏膜的修復(fù)及潰瘍的愈合，從而達(dá)到治療效果。