沖泡條件對(duì)桑葉茶重要生物活性物質(zhì)溶出的影響

楊金宏，陳正余，梁嘉俊，孔衛(wèi)青

（安康學(xué)院／陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000）

桑葉是桑科桑屬多年生木本植物桑樹（Morus alba L.）的葉片，桑葉是養(yǎng)蠶業(yè)的基礎(chǔ)，同時(shí)還具有重要的食、藥用價(jià)值，位列我國衛(wèi)生部公布的藥食同源產(chǎn)品名單，并被收錄于《中華人民共和國藥典》（2010版）。桑葉的藥用價(jià)值早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載，其具有祛風(fēng)清熱、涼血明目的功效，主治風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花。夏桑菊、桑菊感冒丸等目前常見的中成藥配方均有桑葉成分。桑葉富含生物堿1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）、黃酮類化合物以及多糖等生物活性成分［1］。其中1-DNJ具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、維持消化和排泄系統(tǒng)健康、抑制腫瘤等生物活性［2，3］，民間素有利用桑樹嫩葉降血糖的傳統(tǒng)［4］。桑葉黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化能力，具有降血壓、降血糖、清除自由基、抑制血清脂質(zhì)增加和抗粥樣硬化等藥理作用［5］。

同時(shí)桑樹還具有一定富硒能力，自然狀態(tài)下，桑樹的聚硒能力高于普通農(nóng)作物［6］。通過人工添加外源硒的研究發(fā)現(xiàn)，桑樹的聚硒能力受外源硒含量影響顯著［7，8］。安康是我國最大的生態(tài)富硒區(qū)，被譽(yù)為中國硒谷，土壤平均硒含量高達(dá)0.4671 mg／kg［9，10］。安康地區(qū)桑葉茶硒含量最高可達(dá)1.771 5 mg／kg［11］，中藥材中，桑樹的硒含量僅次于豆腐柴［12］。

桑葉茶是利用桑樹嫩葉，參考茶葉工藝加工而成，以沖泡為主要食用方式的茶葉制品。目前對(duì)于桑葉茶的制作及其功能物質(zhì)含量等的研究較多，但對(duì)于不同沖泡條件下各種功能性成分的溶出規(guī)律缺乏相應(yīng)的研究。活性功能化合物的溶出率決定其生物利用度，因此本研究對(duì)安康地區(qū)桑葉茶中的1-DNJ、黃酮和硒含量以及不同沖泡溫度和時(shí)間對(duì)各成分溶出的影響進(jìn)行研究，以期為桑葉茶的科學(xué)沖泡和桑葉的藥源利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

桑葉茶來自陜西福臻茶業(yè)有限公司，葉片源為陜西安康市平利縣的湖桑32，2019年春季生產(chǎn)，桑葉茶干粉為桑葉茶粉碎過80目篩。1-DNJ分析標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000μg／mL）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心，芴甲氧羰酰氯（99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈、硝酸為優(yōu)級(jí)純，購自天津化學(xué)試劑廠。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等為分析純。

1.2 桑葉茶黃酮含量的測定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 使用0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg／mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，按分光光度法［13］測定510 nm處吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 試樣制備與含量測定 稱取桑葉茶粉0.5 g，加入60%乙醇50 mL進(jìn)行提取，60℃提取2 h，10 000×g、25℃離心10 min，取上清液進(jìn)行黃酮含量測定。根據(jù)510 nm處吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品黃酮含量。

1.2.3 沖泡溫度對(duì)桑葉茶黃酮溶出的影響 稱桑葉茶粉0.5 g，分別加入70、80、90、100℃的水25 mL，水浴鍋保溫浸泡5 min，10 000×g、25℃離心10 min，取上清測定510 nm處吸光度，研究不同沖泡溫度桑葉茶黃酮的溶出量。

1.2.4 沖泡時(shí)間對(duì)桑葉茶黃酮溶出的影響 稱桑葉茶粉0.5 g，加入90℃水25 mL，室溫放置，分別沖泡2、4、6、8、10、12 min，10 000×g、25℃離心10 min，取上清測定510 nm處吸光度，研究不同沖泡時(shí)間桑葉茶黃酮的溶出量。

1.3 桑葉茶1-DNJ含量的測定

1.3.1 1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的配制及其衍生化處理 精確稱取1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用50%乙腈溶液配制成0.2、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取100μL樣本液，加入0.4 mol／L硼酸鉀緩沖液0.1 mL，5 mmol／L芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）0.3 mL，25℃反應(yīng)30 min后，加入50%乙腈溶液0.5 mL定容至1 mL。

1.3.2 色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇（A）+1%磷酸溶液（B）。進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL／min，柱溫35℃，走樣時(shí)間為50 min，紫外波長265 nm，設(shè)置完成后用流動(dòng)相過柱子，按照以下梯度運(yùn)行，0～20 min，A為50% ～70%；20～30 min，A為70%；30～35 min，A為70%～50%；35～50 min，A為50%。待基線穩(wěn)定后，將1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐個(gè)進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的1-DNJ濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到回歸方程。

1.3.3 桑葉茶1-DNJ含量的測定 稱取0.1 g桑葉茶干粉，加入50%乙腈溶液1.5 mL，研磨，過夜浸提，離心取上清液。不同溫度和時(shí)間試驗(yàn)處理?xiàng)l件同黃酮溶出試驗(yàn)。樣品的衍生方法、色譜測定條件同標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 桑葉茶總硒含量的測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 移取硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用硝酸溶液按體積關(guān)系分別稀釋配制濃度為0、5、10、20、30μg／L的硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.4.2 試樣制備與含量測定 稱桑葉茶干粉0.5 g于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加硝酸5 mL浸泡過夜。蓋好內(nèi)蓋，旋緊不銹鋼外套，放入恒溫干燥箱，160℃保持4 h，在箱內(nèi)自然冷卻至室溫后，開蓋加熱干燥，將消解液吸入25mL容量瓶，用少量硝酸溶液（1%）洗滌接觸面3次，洗液合并至容量瓶中并用1%硝酸定容備用，同時(shí)做空白對(duì)照，ICP-MS法測定硒含量［14］。不同溫度和時(shí)間處理?xiàng)l件同黃酮溶出試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉茶干粉的黃酮、1-DNJ和硒含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別用蘆丁、1-DNJ和標(biāo)準(zhǔn)硒溶液制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝2.510x+0.007，R2＝0.9996，表明吸光度值與濃度之間存在較好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2大于0.99，說明試驗(yàn)的準(zhǔn)確性高，分析結(jié)果穩(wěn)定。1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝77.4020x+1.6897，R2＝0.9997，說明1-DNJ質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。硒標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度回歸方程y＝147.260x+41.603，R2＝0.9998，表明硒濃度在0～30μg／L與熒光度呈良好的線性關(guān)系，硒的檢出最低限為0.13μg／L。

圖1 蘆丁、1-DNJ和硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 桑葉茶黃酮、1-DNJ、硒含量 本研究設(shè)置2個(gè)樣品重復(fù)，根據(jù)計(jì)算公式，獲得桑葉茶中黃酮的含量為8.9120 mg／g，1-DNJ的含量為3.5516 mg／g，硒含量為0.2166 mg／kg（表1）。

表1 桑葉茶總黃酮、1-DNJ和硒含量

2.2 沖泡溫度對(duì)桑葉茶各成分溶出的影響

桑葉茶中黃酮、1-DNJ和硒三種功能成分的溶出量都隨沖泡水溫度的升高而增加，100℃時(shí)溶出最多（圖2）。這與茶葉沖泡水溫高一次浸出率高，沖泡水溫低一次浸出率低的結(jié)果一致。硒、1-DNJ和黃酮的溶出與溫度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（Pearson’s R）分別為0.9925、0.9483和0.9943。其中1-DNJ在90℃增加最為明顯，較80℃增長1倍多。水溫過高時(shí)，葉綠素和多酚容易被氧化，桑葉中的單寧、凝集素、鞣酸等容易浸出，苦澀味道加重，因此認(rèn)為90℃是比較適合于桑葉茶的沖泡溫度。

圖2 沖泡溫度對(duì)桑葉茶總黃酮、1-DNJ和硒溶出的影響

2.3 沖泡時(shí)間對(duì)桑葉茶各成分溶出的影響

沖泡時(shí)間短，茶湯顏色相對(duì)好，明亮度高；沖泡時(shí)間長，茶湯濃，澀味物質(zhì)溶出較多，影響口感。所以在沖泡溫度90℃時(shí)，進(jìn)一步研究沖泡時(shí)間對(duì)桑葉茶各成分溶出的影響。結(jié)果表明黃酮隨沖泡時(shí)間延長而增多，最優(yōu)擬合曲線為直線，y＝0.4401x+2.3740，R2＝0.9969，沖泡12 min，黃酮溶出7.53 mg／g，溶出率為84.49%（圖3）。

1-DNJ和硒元素溶出也隨沖泡時(shí)間延長而增多，但這兩種功能物質(zhì)的溶出曲線為對(duì)數(shù)函數(shù)（圖4）。1-DNJ的溶出曲線為y＝141.89ln（x）+73.82，R2＝0.9915，沖泡12 min的溶出率為9.36%，用正常的泡茶方法不能得到很好的利用。硒的溶出曲線為y＝15.50ln（x）+44.74，R2＝0.9665，沖泡12 min，溶出0.071μg／g，溶出率為32.85%，可以通過正常沖泡桑葉茶獲得一定的補(bǔ)硒效果。

圖3 沖泡時(shí)間對(duì)桑葉茶黃酮溶出的影響

圖4 沖泡時(shí)間對(duì)桑葉茶1-DNJ和硒溶出的影響

3 討論與結(jié)論

我國桑樹資源豐富，種類繁多，分布廣泛，桑葉中功能成分含量受到諸多因素的影響，如桑葉中的黃酮和產(chǎn)地有關(guān)［15，16］，在國家種質(zhì)（鎮(zhèn)江）桑樹圃，不同品種桑葉總黃酮含量在35.67～63.92 mg／g之間，野生桑樹含量較高［17］。河北省內(nèi)不同品種及生長時(shí)期桑葉中總黃酮含量也存在差異，在22.47～32.65 mg／g之間［16］。本研究對(duì)產(chǎn)自陜西省安康市平利縣的桑葉茶黃酮含量進(jìn)行測定，桑葉茶的黃酮含量為8.9120 mg／g，12 min的溶出率為84.49%，隨時(shí)間呈線性增長趨勢。這與明日葉茶的總黃酮溶出量在15 min內(nèi)隨沖泡時(shí)間延長，迅速增加的研究結(jié)果一致［18］。

植物葉片的硒元素含量受多種因素影響，如植物種類、氣候、土壤硒含量等。安康地處富硒帶，本研究測得桑葉中硒元素含量為0.2166 mg／kg，而且以有機(jī)硒為主（無機(jī)硒未檢測到），符合富硒茶標(biāo)準(zhǔn)（GH／T 1090—2014）中硒含量要求（0.2～4.0 mg／kg）。本研究桑葉茶中硒的溶出規(guī)律符合對(duì)數(shù)方程，這與鳳凰單叢古茶樹葉片中硒的溶出規(guī)律一致［19］。本研究桑葉茶沖泡12 min硒溶出率為32.85%，溶出量為0.071μg／g，雖然高于鳳凰單叢古茶樹葉片硒的最大溶出量0.015μg／g，但泡茶方法不能充分利用桑葉茶中硒元素，需進(jìn)一步改善加工利用工藝，提高硒的利用率。

桑葉中1-DNJ含量是衡量桑葉藥用價(jià)值的重要指標(biāo)，其含量受桑樹品種、桑葉成熟度和采摘季節(jié)等影響［20-22］。1-DNJ的水溶出率較低，葉晶晶等利用正交試驗(yàn)，優(yōu)化80℃以內(nèi)水溫、pH、料液比等獲得1-DNJ的最高得率僅為0.062%［23］。由于桑葉茶主要食用其茶湯，溶出率是決定其有效成分生物利用的先決條件。本研究測得桑葉茶1-DNJ含量為3.5516 mg／g，沖泡水溫由80℃提高至90℃，1-DNJ的溶出有顯著提高，溶出率增加了1倍，但也僅為9.36%，說明用正常的泡茶方法不能很好地利用1-DNJ。