一株青枯菌拮抗細菌M26的篩選、鑒定及其發酵條件優化

陳丹丹，李圓圓，齊素敏，冉新炎，韓廣泉，陶寧，王麗榮

（山東碧藍生物科技有限公司／泰安市植物微生態制劑重點實驗室，山東 泰安 271000）

番茄（Solanum lycopersicum L.）是管狀花目茄科番茄屬一年或多年生草本植物，為我國主要的蔬菜之一。番茄營養豐富，其含有的番茄紅素具有抗氧化、清除自由基、延遲衰老和抗癌的功效［1］，具有很大的經濟效益。隨著番茄種植面積的不斷擴大，番茄青枯病也越來越嚴重。番茄青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種常見的維管束系統性病害之一，發病嚴重時可造成植株死亡，導致番茄嚴重減產甚至絕收［2］。

利用生防菌防治番茄土傳病害是一種有應用前景的防治措施［3］。芽孢桿菌（Bacillus）是一類研究較多的生防細菌，當前用于防治青枯病的芽孢桿菌有解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）［4-6］、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［7，8］、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）［9］、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）［10］、耐寒短桿芽孢桿菌（Brevibacterium frigoritolerans）［11］、特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）［11］、多 粘 芽 孢 桿 菌（Paenibacillus polymyxa）［12］等。美國迄今已有1個解淀粉芽孢桿菌FZB42和3個枯草芽孢桿菌GB03、MB1600、QST713獲得商品化生產許可［13］。

本試驗篩選到一株抑制青枯雷爾氏菌的細菌M26，通過16S rRNA基因序列、形態學和生理生化特征分析，確定其為解淀粉芽孢桿菌，并對其發酵條件進行優化，為開發該菌株成為青枯病生防菌提供參考，同時豐富了防治青枯病的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：青枯雷爾氏菌，購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心；其他菌株由山東碧藍生物科技有限公司菌種保藏中心保存。

供試培養基：芽孢培養基（YB）：葡萄糖2 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH＝7.0，固體培養基（YA）加瓊脂粉15 g；青枯培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，酵母提取物0.2 g，牛肉提取物3 g，氯化鈉0.5 g，七水硫酸鎂1.5 g，水1 L，pH ＝7.0，固體培養基加瓊脂粉15 g和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）100μL；2%營養瓊脂培養基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH值為7.2～7.4，瓊脂粉20 g，1%NA培養基加瓊脂粉10 g。所有培養基121℃滅菌30 min備用。

主要試劑和儀器：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯化鈉等，均為分析純試劑；天根細菌基因組DNA提取試劑盒；PCR引物，由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成；HBI芽孢桿菌生化鑒定條，由青島海博生物技術有限公司生產；BIO-RAD PCR儀，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；OLYMPUS CX31型顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TANON-1600全自動數碼凝膠成像分析系統，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌的初篩 菌液的制備：將青枯菌接種于青枯液體培養基中，30℃、180 r／min搖床培養48 h后備用；將保存的拮抗菌接種到YB培養基中，37℃、180 r／min搖床培養24 h后備用。

初篩方法：采用平板孔擴散法。底層為20 mL的2% NA培養基，待培養基凝固后加入1 mL的青枯菌和5 mL的1% NA培養基搖勻，等液體干透后用打孔器（直徑9 mm）距離中心3 cm打4個孔，每孔中加100μL的生防菌液，每個處理重復3次，抑菌圈直徑按十字交叉法進行測量。

1.2.2 拮抗菌的復篩 從初篩結果中選取抑菌效果比較好的菌株進行復篩，方法如1.2.1，選出抑制效果最好的1株細菌。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 利用細菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA，使用細菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）：DNA模板2 μL，Mix 25μL，27F 1μL，1492R 1μL，ddH2O 21 μL。PCR擴增程序：95℃4 min；94℃30 s，52℃80 s，72℃90 s，30個循環；72℃8 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序，測序后的拼接結果在NCBI上進行BLAST相似序列檢索比對，采用MEGA 6.0軟件進行多序列同源性分析，并構建系統進化樹。

形態學和理化特征試驗：將拮抗菌接種于YA培養基中，37℃培養24 h，觀察菌落形態、大小、邊緣、表面、凹凸度、透明度等，并進行革蘭氏染色和芽孢染色［14］，具體方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》［15］。

1.2.4 發酵條件優化 （1）種子液制備：將復篩得到的拮抗菌接種至YB培養基中，37℃、180 r／min培養24 h待用。

（2）發酵條件優化：按照1／15（V／V）的接種量接種于YB培養基培養24 h，分別檢測不同溫度（25、30、35、45、55℃）、不同pH值（5、6、7、8、9）、不同NaCl含量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、不同轉速（150、180、210 r／min）、不同裝載量（15%、25%、40%、50%）下600 nm的光密度值，每個試驗組設3個重復。

1.3 數據處理

采用SPSS軟件包單因素方差分析法（oneway ANOVA）中的Duncan’s多重比較檢驗法進行數據分析和差異顯著性檢驗（P＜0.05），利用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

選取保存的40株菌進行純化，編號為M1、M2、… 、M40。有5株細菌對青枯雷爾氏菌有較強的抑制作用，抑制結果如表1所示。其中菌株M26對青枯雷爾氏菌具有很強的抑制作用，抑菌圈直徑達14.34 mm，復篩平均抑菌圈直徑達15.22 mm。經過連續多次試驗后抑菌效果穩定（圖1），所以對菌株M26進行進一步研究。

表1 5株細菌對青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑 （mm）

2.2 M26菌株16S rRNA基因序列分析

電泳結果（圖2）顯示，PCR產物長度在1 500 bp左右。測序結果顯示M26菌株16S rRNA基因的序列長度為1 453 bp，與電泳結果一致。M26與Bacillus amyloliquefaciens strain BA31（MG548650）相似性達到99.79%。系統進化樹也顯示M26與B.amyloliquefaciens strain BA31（MG548650）在同一系統分支上（圖3）。因此，初步鑒定M26為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 M26菌株對青枯雷爾氏菌的抑制效果

圖2 M26菌株16S rRNA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的M26及相關菌株的系統發育樹

2.3 菌株M26的形態和生理生化特征

菌株M26在YA培養基上37℃培養24 h后，菌體呈桿狀，有莢膜和芽孢；菌落為乳白色，呈圓形，直徑在0.35～0.45 cm，表面有褶皺，中心部分凸起，邊緣為鋸齒狀，不透明，不產生色素。部分生理生化特征見表2，與B.amyloliquefaciens的生理生化特征［16，17］最為接近。

表2 M26菌株的生理生化特征

2.4 菌株M26的發酵條件優化

由圖4可知，菌株M26在25～55℃范圍內均能生長，25℃和35℃的差異不顯著，但是在25℃時生長最好（圖4 A）；在25℃條件下，M26在pH值5～9范圍內均能生長，在pH＝7下生長最好（圖4 B）；在25℃、pH＝7條件下，M26在NaCl含量為0～2%的條件下均能生長，0.5%NaCl含量下生長最好（圖4 C）；在25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量下，180 r／min下OD600顯著低于150 r／min和210 r／min，在150 r／min條件下生長最好（圖4 D）；在上述優化條件下，裝載量為40%下生長的最好（圖4 E）。綜上可知：解淀粉芽孢桿菌M26在25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量、轉速為150 r／min、40%裝載量條件下生長的最好。

圖4 不同發酵條件下菌株M26的生長情況

3 討論與結論

解淀粉芽孢桿菌可通過產生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物質抑制植物病原菌、真菌、病毒和線蟲［18-20］。其易于生產，對環境友好，是一類重要的生防資源［21］。有研究表明：解淀粉芽孢桿菌對番茄青枯菌有很強的拮抗作用［22，23］；枯草芽孢桿菌、解淀粉桿菌和地衣芽孢桿菌能夠抑制青枯病的發生，且枯草芽孢桿菌抑菌能力最強，可使感染率降低80%［24］；解淀粉芽孢桿菌BS2004、SQY162和SQRT3對番茄青枯病的防治效果在70%以上，最高可達到81.25%，且均能夠促進番茄植株生長［25-27］。

解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的親緣性很高，對人體及其它生物無害，因此被廣泛應用于飼料、植物病害防治及果蔬保鮮中［28］。本研究對菌株M26的發酵溫度進行優化時，在45℃生長最差，而在35℃和25℃均生長良好。符可芯等［17］的研究表明，解淀粉芽孢桿菌在高于45℃時菌體生長放緩，OD值下降，且在55℃的OD值高于25℃的，與本研究結果不一致，可能是解淀粉芽孢桿菌菌株的差異性所造成的。劉芳等［21］的研究表明，隨著溫度的升高，枯草芽孢桿菌BZJN1的芽孢數減少，45℃時降到最低，與本研究結果一致。

通過分析M26菌株的16S rRNA序列、形態和生理特征，確定M26為解淀粉芽孢桿菌。M26菌株的最佳培養條件為溫度25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量、轉速150 r／min、裝載量40%。本試驗為解淀粉芽孢桿菌的生產工藝提供了參考數據。