硫氧還蛋白相互作用蛋白在結腸癌中表達的變化及其調節結腸癌細胞增殖機制研究

席連峰

（河南省滑縣中心醫院普外科 滑縣456400）

結腸癌是我國發病率較高的消化道惡性腫瘤之一，且近年來發病率呈逐步升高趨勢[1]。其發生與環境、飲食、遺傳因素及多種基因表達異常有關，但具體發病機制仍未完全闡明。硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）是一類氧化還原調節蛋白，與硫氧還蛋白結合后能夠使硫氧還蛋白清除自由基的抗氧化作用減弱，進而使細胞內自由基增多并影響細胞增殖活力。已有研究報道，TXNIP在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均呈顯著的低表達趨勢，提示TXNIP可能具有抗腫瘤作用[2～3]。為了明確TXNIP在結腸癌發生發展中的生物學作用，本研究首先通過臨床樣本分析了TXNIP在結腸癌中表達變化，而后通過離體培養結腸癌SW480細胞分析了TXNIP調節結腸癌細胞增殖的機制。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床樣本信息 選取2018年3月～2019年12月在我院接受根治性手術治療的結腸癌患者的結腸癌組織和癌旁組織，共54例。所有患者均經術后病理證實為結腸癌，術前未接受過放化療或其他抗腫瘤治療，臨床病理資料完整。獲得結腸癌組織和癌旁組織后，在液氮內冷凍30 min后取出，放入超低溫冰箱保存備用。

1.2 實驗材料SW480細胞株購自中科院上海細胞資源中心，TXNIP慢病毒購自上海吉瑪公司，p38 MAPK抑制劑SB203580購自Sigma公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，MTS細胞增殖活力檢測試劑盒購自Promega公司，TXNIP、CyclinD1、Bcl-2、p53的單克隆抗體購自Abcam公司。多功能酶標儀及化學顯影儀均購自Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養及分組SW480細胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM進行貼壁培養，貼壁細胞鋪滿90%后用胰蛋白酶進行消化并按1:3比例傳代；傳代得到足夠數量的SW480細胞后進行分組，對照組用不含藥物的DMEM處理，TXNIP組用TXNIP慢病毒感染，TXNIP+SB組用TXNIP慢病毒感染并用含20μmol/L的SB203580 DMEM處理。

1.3.2 細胞增殖活力檢測SW480細胞接種在96孔培養板內，不同條件處理24 h后向培養孔內加入MTS試劑盒的檢測液、20μl/孔，在培養箱內繼續培養4 h后取出，充分震蕩培養板并在酶標儀上檢測波長490 nm處的吸光值、記錄為OD值。

1.3.3 Western blot檢測 結腸癌組織和癌旁組織，用RIPA蛋白裂解液對組織進行裂解并提取蛋白；SW480細胞接種在6孔培養板內，不同條件處理24 h后用RIPA蛋白裂解液對細胞組織進行裂解并提取蛋白。得到蛋白后，用BCA試劑盒測定總蛋白含量并取30μg進行Western blot檢測，將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中并進行電泳、電轉膜、5%脫脂牛奶封閉及TXNIP、CyclinD1、Bcl-2、p53第一抗體孵育過夜。第2天，孵育第二抗體后在化學顯影儀中曝光得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.4統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件分析數據，計量資料的兩組間比較采用t檢驗、三組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌中TXNIP表達的變化 結腸癌組織和癌旁組織中TXNIP的表達量分別為（0.36±0.07）和（0.91±0.16）。結腸癌組織中TXNIP的表達量明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（t=23.142，P=0.000）。見圖1。

圖1 結腸癌組織和癌旁組織中TXNIP的蛋白條帶

2.2 不同病理特征結腸癌中TXNIP表達的比較不同直徑結腸癌中TXNIP的表達量比較無顯著性差異（P＞0.05）；TNMⅢ期結腸癌中TXNIP的表達量明顯低于TNMⅠ～Ⅱ期結腸癌（P＜0.05）；低/未分化結腸癌中TXNIP的表達量明顯低于中/高分化結腸癌（P＜0.05）；合并淋巴結轉移的結腸癌中TXNIP的表達量明顯低于不合并淋巴結轉移的結腸癌（P＜0.05）。見表1。

表1 不同病理特征結腸癌中TXNIP表達比較（±s）

表1 不同病理特征結腸癌中TXNIP表達比較（±s）

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2.3 TXNIP慢病毒對SW480細胞增殖活力的影響TXNIP組SW480細胞的OD值明顯低于對照組（P＜0.05）；TXNIP+SB組SW480細胞的OD值明顯高于TXNIP組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 三組SW480細胞增殖活力的比較

2.4 TXNIP慢病毒對SW480細胞中增殖基因表達的影響TXNIP組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2表達量明顯低于對照組，p53表達量明顯高于對照組（P＜0.05），TXNIP+SB組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2的表達量明顯高于TXNIP組，p53的表達量明顯低于TXNIP組（P＜0.05）。見圖3，表2。

圖3 三組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2、p53的蛋白條帶

表2 三組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2、p53表達量比較（±s）

表2 三組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2、p53表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TXNIP組比較，#P＜0.05。

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3 討論

TXNIP是一類氧化還原調節蛋白，既拮抗硫氧還蛋白的抗氧化功能，也能調節細胞內的線粒體功能，最終實現對細胞增殖的抑制作用及對細胞凋亡的促進作用。已有多項離體細胞實驗證實，過表達TXNIP能夠使肝癌、前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤細胞的凋亡被增強、增殖受抑制[4～5]。提示TXNIP能夠在離體惡性腫瘤細胞中發揮抗腫瘤作用。本研究在此基礎上具體分析了TXNIP在結腸癌發生發展過程中是否發揮抗腫瘤作用，通過分析結腸癌中TXNIP表達的變化可知：結腸癌組織中TXNIP的表達明顯減少且TNMⅢ期、低/未分化、合并淋巴結轉移的結腸癌中TXNIP表達減少的趨勢較TNMⅠ～Ⅱ期、中/高分化、不合并淋巴結轉移的結腸癌組織更為明顯。說明TXNIP的低表達不僅參與了結腸癌的發生，還在結腸癌的病理進程中起到調控作用。結合TXNIP在離體細胞中抑制增殖、促進凋亡的作用推測，低表達的TXNIP能夠使其增殖抑制作用減弱，進而促進了結腸癌的發生與發展。

本研究為了驗證關于TXNIP調控結腸癌細胞增殖的推測，進一步以SW480結腸癌細胞株作為實驗對象，通過感染TXNIP慢病毒的方式使細胞中TXNIP發生過表達，在過表達TXNIP后對細胞增殖進行檢測。結果顯示，TXNIP組細胞的增殖活力明顯低于對照組，說明過表達TXNIP能夠降低SW480細胞的增殖活力、TXNIP具有抑制結腸癌細胞增殖的作用。CyclinD1、Bcl-2、p53是已知與結腸癌增殖和凋亡調控密切相關的基因，CyclinD1能夠在細胞周期中起到正向調控作用，加速細胞周期并使大量細胞進入有絲分裂階段、進而促進細胞增殖[6]。Bcl-2能夠在細胞凋亡中起到抑制作用，通過減少線粒體中細胞色素C的釋放來抑制線粒體途徑凋亡的發生，進而有利于細胞增殖[7]。p53能夠在細胞凋亡中起到正向調控作用，一方面通過增強caspase的活性來促進細胞凋亡，另一方面通過誘導細胞周期停滯來抑制細胞增殖[8]。本研究對上述增殖基因分析顯示，TXNIP組細胞中CyclinD1、Bcl-2的表達明顯減少，p53表達明顯增多，這一結果與細胞增殖活力的變化相吻合，說明TXNIP能夠使結腸癌細胞的增殖受到抑制。

在明確TXNIP參與結腸癌細胞增殖的調控后，本研究進一步深入探究了介導該調控作用的分子機制。糖尿病相關細胞實驗證實TXNIP能夠通過激活p38 MAPK通路來促進胰島MIN6細胞發生凋亡[9]；肝臟相關的動物實驗證實敲除TXNIP后能夠通過抑制p38 MAPK的激活來減輕肝細胞的缺血再灌注損傷。p38 MAPK屬于MAPK家族，發生活化后對細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期等環節均具有調控作用[10]。SB203580是p38 MAPK激活的抑制劑，本實驗在過表達TXNIP的同時聯合使用SB203580，當p38 MAPK的激活被SB203580抑制后，TXNIP抑制SW480細胞增殖、調節SW480細胞中增殖基因表達的作用均明顯減弱，說明TXNIP抑制結腸癌細胞增殖的作用與p38 MAPK的激活有關。p38 MAPK通路的激活部分介導了TXNIP對結腸癌細胞增殖及相關基因表達的調控效應。

綜上所述，結腸癌中TXNIP的表達明顯減少且TXNIP能夠通過激活p38 MAPK通路來抑制結腸癌細胞增殖，今后可進一步設計動物實驗來驗證TXNIP對結腸癌移植瘤生長的調控作用。