采用他克莫司建立免疫抑制小鼠模型

鄭小菲，朱娟芳，王素蘋，喻瓊瓊，甘抗

(鄭州大學第一附屬醫院 口腔醫學中心，河南 鄭州 450052)

他克莫司(FK506)是從鏈霉菌屬中分離的一種發酵產物，作為一種強力的新型免疫抑制劑，目前已成為臨床中器官移植患者最常用的免疫抑制劑之一[1]。他克莫司的免疫作用機制是通過與細胞內親免疫素FK506結合蛋白(FKBP12)結合，形成FK506/FKBP12復合體，該復合體抑制鈣調磷酸酶活性[2-3]，抑制白細胞介素2、腫瘤壞死因子α等細胞因子的分泌，從而阻止T淋巴細胞的活化和增殖，發揮免疫抑制效應[2,4]。雖然他克莫司與傳統的免疫抑制劑環孢菌素A的作用機制相似，但是他克莫司的免疫抑制效應更強大，是環孢菌素A的10～100倍[5]。另外，他克莫司在引起高血壓和高脂血癥方面的副作用相對更小，對腎功能無影響[6]，且肝毒性較環孢菌素A低[7]。鑒于以上優勢，他克莫司已逐漸取代環孢菌素A，成為肝、腎等器官移植患者的首選免疫抑制藥物。移植后排斥反應對傳統免疫抑制方案耐藥者也可選用該藥物。

本研究擬通過連續2周給予他克莫司建立免疫抑制狀態的小鼠模型，并通過檢測小鼠的胸腺和脾臟指數、外周血T淋巴細胞亞群比例及脾臟T細胞增殖進行模型鑒定。本研究旨在探索采用他克莫司建立免疫抑制小鼠模型的方法和效果，從而為采用免疫抑制模型的相關動物研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗器材 電子天平(Sartorius，美國)，微量移液槍(Eppendorf，德國)，離心機(Thermo scientific，美國)，流式細胞儀(Cytomic FC500，BECKMAN，美國)，光學顯微鏡(Nikon Eclipse E600，日本)，Image J軟件(NIH，美國)。

1.1.2實驗試劑 他克莫司(Sigma，美國)，生理鹽水，乙醇，氯胺酮，甲苯噻嗪，PBS緩沖液，FITC-CD4單克隆抗體(eBioscience，美國)，PE-CD8單克隆抗體(eBioscience，美國)，紅細胞裂解液(biosharp，中國)，40 g·L-1多聚甲醛，雙蒸水。

1.2 實驗動物與分組10周齡雄性C57BL/6小鼠購于鄭州大學實驗動物中心，于SPF級動物房飼養，動物質量合格。本研究經鄭州大學生命科學倫理審查委員會審批通過。根據嚙齒類動物的標準飼養條件飼養實驗動物，實驗動物可自由攝食和飲水，飼養環境溫度為(23±2)℃，濕度55%。每12 h交替進行白晝和黑夜變換。

1.3 模型建立他克莫司水溶性差，極易溶于乙醇、三氯甲烷、二甲基亞砜等有機溶劑。采用乙醇將他克莫司溶解至儲存濃度，使用前用生理鹽水稀釋至注射濃度(0.1 g·L-1)。將實驗所用小鼠在適應性飼養1周后隨機分為對照組和模型組。對模型組小鼠腹腔內注射他克莫司(1 mg·kg-1·d-1)，對照組小鼠腹腔內注射等劑量的生理鹽水。連續注射2周后，檢測相關指標評估小鼠的免疫狀態。

1.4 檢測指標

1.4.1小鼠器官質量指數的測定 連續給藥2周后，稱小鼠質量，腹腔內注射過量麻醉藥處死動物，解剖后完整取出脾臟和胸腺，濾紙吸去表面殘血，于十萬分之一電子天平上稱質量。器官質量與小鼠質量之比為器官指數。

1.4.2外周血T細胞亞群百分率檢測 小鼠行腹腔麻醉(氯胺酮0.1 mg·g-1加入甲苯噻嗪0.01 mg·g-1)后，摘除小鼠眼球，立即取血100 μL，收集于肝素抗凝管中；加入2 μL FITC-CD4抗體和2.5 μL PE-CD8抗體混合，室溫下避光孵育15 min；加入600 μL紅細胞裂解液，裂解紅細胞2 min，離心(500×g，5 min)，加入1 mL PBS洗滌1次，棄上清液；用500 μL PBS重懸細胞，立即上流細胞儀檢測，分析外周血中CD4+/CD8+T細胞比例。

1.4.3脾臟T細胞增殖實驗 選用刀豆蛋白A(ConA)作為促有絲分裂素，MTT法檢測小鼠脾臟T淋巴細胞的增殖能力。具體步驟：研磨脾臟，溶解于RPMI-1640培養液中，獲得細胞懸液，將組織通過細網細胞過濾器；紅細胞裂解液去除紅細胞，清洗，離心，溶于含10%FBS的RPMI-1640培養液中；細胞計數，吸取100 μL細胞密度為1×10-7mL-1細胞溶膠接種于96孔培養板中，加入ConA(100 μL，5 mg·L-1)，對照孔不加ConA，培養48 h；加入MTT試劑(20 μL，5 g·L-1)，繼續培養4 h；棄去培養液，加入150 μL DMSO，用酶標儀測定波長570 nm處OD值。ODConA與OD對照孔之比為增殖指數。

1.5 統計學分析采用SPSS 22.0軟件處理數據，計量資料以均數±標準誤表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物大體觀察給藥2周后，模型組小鼠開始出現精神萎靡，喜靜少動，毛色晦暗。模型組小鼠質量為(21.44±0.97)g，對照組小鼠質量為(18.97±0.83)g，差異無統計學意義(P<0.05)。

2.2 小鼠器官指數對照組和模型組小鼠的脾臟指數和胸腺指數見表1。模型組小鼠在他克莫司作用下器官指數降低，與對照組小鼠相比，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 他克莫司對小鼠質量和器官指數的影響

2.3 外周血中CD4+/CD8+T細胞的流式分析流式分析結果顯示，給予他克莫司2周后，對照組小鼠的CD4+/CD8+T淋巴細胞的比例為3.24±0.28，模型組小鼠的細胞比例為1.67±0.39。與對照組小鼠相比，模型組小鼠外周血中的CD4+/CD8+T細胞亞群比例降低(P<0.05)。

2.4 脾臟T細胞增殖能力的檢測MTT結果顯示，模型組小鼠脾臟T細胞的增殖指數為2.06±0.15，低于對照組小鼠的T細胞增殖指數(5.25±0.25)(P<0.05)。

3 討論

在疾病研究過程中組織工程研究領域，構建動物模型是一種較為普遍的實驗手段。臨床應用前的動物研究選用的動物模型有犬、豬、兔和大鼠等動物。根據文獻內容發現，隨著動物個體的增大，樣本量呈現明顯的下降趨勢，難以保證實驗研究所需的樣本數[8]。本研究選用小鼠作為動物模型，具備許多明顯的優點：(1)小鼠來源方便，可以保證實驗研究的動物個數；(2)小鼠質量輕，實驗所需的藥物劑量小。他克莫司注射劑量(1 mg·kg-1·d-1)的選擇是基于先前的文獻報道[9]。通過腹腔注射給藥可以避免口服給藥所帶來的操作困難、實際服用藥量的不確定性和多樣性[10]。

脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官。脾臟是機體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，是T、B淋巴細胞接受抗原刺激后增殖和發生特異性免疫應答的場所；胸腺主要介導細胞免疫反應，是T細胞分化成熟的重要場所。因此，脾臟和胸腺的相對質量與免疫功能的強弱有著密切關系[11]。免疫器官指數的分析結果表明，相比于對照組小鼠，給予他克莫司2周后模型組小鼠的脾臟指數和胸腺指數均顯著降低。

T細胞增殖是機體針對抗原刺激產生免疫應答的重要過程，能夠反映機體的細胞免疫效應。T細胞包含CD4+和CD8+亞群，各亞群及CD4+/CD8+T細胞比例是評價免疫狀態的一個重要指標[12]。該比值降低標志著機體免疫功能的減弱[13]。流式細胞術有精確、快速、靈敏等優點，且具有定性和定量分析的特點，被認為是血液中淋巴細胞表型分析的標準方法。此研究利用流式細胞儀分析外周血中CD4+/CD8+T細胞比例，通過MTT法檢測T細胞增殖。結果表明，他克莫司作用下的模型組小鼠體內CD4+/CD8+T細胞比例降低，T細胞增殖能力減弱。

本實驗通過比較兩組動物的免疫器官指數、T細胞亞群比例、T細胞增殖評估小鼠的免疫狀態，連續2周注射藥物他克莫司成功建立了免疫抑制的小鼠模型。該研究結果可以為采用免疫抑制動物模型的相關研究提供實驗基礎。