大黃素對類風濕關節炎模型大鼠的治療作用及抗炎機制研究

田新瑋 鄭琦麗 王 靜 蘇敏慧 周文濤 陳 昶

（1.新疆醫科大學第五附屬醫院，新疆烏魯木齊830011；2.滕州市中醫醫院，山東滕州277500）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其主要表現為滑膜炎癥，同時會引起關節細胞壞死等[1]。RA可歸屬于中醫學“痹證”范疇，主要由于風、寒、濕邪侵襲，導致氣血凝滯，經絡痹阻而引起肢體關節病變[2-3]。目前治療RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質激素以及植物藥[4]。大黃素是中藥虎杖的生物活性組分，具有抗腫瘤、抗微生物生長、解痙、止咳和利尿等作用，對RA具有治療作用[5-6]。彭菲菲等[7]研究表明，大黃素對體外培養的RA患者成纖維樣滑膜細胞增殖及轉移有一定的抑制作用。本研究旨在觀察大黃素對類風濕關節炎模型大鼠的治療作用，并探索其治療機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級3周齡SD大鼠60只，購自廣東醫學院實驗動物中心，粵監證字2004A029號。所有大鼠均在新疆醫科大學動物中心實驗室飼養，飼養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%。本實驗經新疆醫科大學動物倫理委員會批準同意，審批編號：20180302145。

1.2 藥物與試劑 大黃素（貨號：E8390；純度＞98%）購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購自美國Sigma公司；B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）及Bcl-2關聯X蛋白（Bax）抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3，貨號sc-7272）、高遷移族轉移蛋白1（HMGB1，貨號sc-74085）購自美國Santa Cruz公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.3 主要儀器 BS-124s型電子天平，北京賽多斯儀器系統有限公司；3-5W低溫離心機，湖南恒諾離心機有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡，上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉膜儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統，以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機，長沙益廣制藥機械公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥 將60只大鼠適應性喂養1周，隨機分為空白對照組、模型組、大黃素低劑量組和大黃素高劑量組，每組15只。除空白對照組外，其余各組大鼠采用不完全氟氏佐劑及牛Ⅱ膠原乳化劑制成類風濕關節炎大鼠模型，制作方法及判斷造模是否成功參考黃順等[8]的研究。具體操作如下：將乙酸溶液中溶解牛Ⅱ型膠原制成2 g/L的膠原溶液，取400 μg膠原乳化劑注射于大鼠右足跖部皮下以致炎，并于造模第14日用100 μg膠原乳化劑同法注射以加強。炎癥表現程度大約在造模20 d左右達到高峰。20 d時通過大鼠足跖相機拍照和X線攝片觀察，出現嚴重紅腫、連續低密度影及溶骨現象表明造模成功。本研究所有造模大鼠均造模成功。造模第21日開始，大黃素低劑量組和高劑量組分別予40 mg/kg和80 mg/kg大黃素灌胃，空白對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，每日灌胃1次，持續14 d。

2.2 觀察指標

2.2.1 大鼠足腫脹度檢測并計算腫脹率 用水容積法檢測各組大鼠足腫脹度。從造模開始后每周末檢測1次共檢測5次，同一只大鼠每次檢測同一只足。以第1次測得的關節置換水容積為基值，以后每測得的值與之相比得出的比值為關節腫脹率。

2.2.2 血清炎癥因子檢測 末次給藥并完成足腫脹度檢測后，各組大鼠麻醉，腹主動脈取血分離血清0.5 mL，在低溫離心機中以離心半徑8 cm，3000 r/min離心15 min，取上清液嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

2.2.3 大鼠滑膜病理學評分 取血后處死大鼠，取右足踝關節，剪開皮膚，用顯微外科手術剪刀和鑷子在髖關節的周圍剪下滑膜組織（為白色海綿狀），清理，修剪，固定于4%多聚甲醛中，關節組織直接凍存。觀察各組大鼠滑膜細胞增生、滑膜下層炎癥程度及血管生成情況，對大鼠滑膜病理學進行評分。滑膜細胞增生評分：0分，少于3層；1分，3～4層；2分，5～6層；3分，6層以上。炎癥程度評分：0分，無淋巴細胞浸潤；1分，淋巴細胞聚集；2分，出現炎細胞浸潤且形成淋巴濾泡；3分，出現較多炎性細胞且以濾泡增生為主伴生發中心進行性轉化。血管生成評分：0分，無新生血管生成；1分，輕度新生血管生成；2分，中度新生血管生成；3分，重度新生血管生成。以上3項評分總和即為滑膜病理學總評分。

2.2.4 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測大鼠關節組織蛋白表達 使用Western Blot檢測HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白。取凍存的大鼠關節組織，剪刀剪碎，胰蛋白酶消化，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以β-actin為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

2.3 統計學方法 本研究數據分析采用SPSS 22.0統計學軟件，作圖采用GraphPad Prism 5軟件，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05則表明數據差異有統計學意義，本研究所有檢驗均為雙側檢驗。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠足腫脹率比較 實驗第1、2周末，各組大鼠足腫脹率比較無統計學差異（P＞0.05）；實驗第3、4、5周末，模型組和大黃素低、高劑量組大鼠足腫脹率顯著高于空白對照組（P＜0.01）；實驗第4、5周末大黃素低、高劑量組大鼠足腫脹率顯著低于模型組（P＜0.01），且高劑量組明顯低于低劑量組（P＜0.01）。見表1。

3.2 各大鼠血清炎癥因子比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠上述指標顯著降低（P＜0.01），高劑量組明顯低于低劑量組（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠實驗各時期足腫脹率比較（±s）

表1 各組大鼠實驗各時期足腫脹率比較（±s）

注： 與同時期空白對照組比較，**P＜0.01；與同時期模型組比較，##P＜0.01；與同時期大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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表2 各組大鼠血清炎癥因子比較（±s） 單位：pg/mL

表2 各組大鼠血清炎癥因子比較（±s） 單位：pg/mL

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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3.3 各組大鼠滑膜病理學評分比較 見表3。

3.4 各組大鼠關節組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達比較 見圖1、表4。

表3 各組大鼠滑膜病理學評分比較（±s） 單位：分

表3 各組大鼠滑膜病理學評分比較（±s） 單位：分

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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圖1 各組大鼠關節組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達比較

表4 各組大鼠關節組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠關節組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達比較（±s）

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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4 討論

類風濕關節炎是一種以滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，抗體即類風濕因子會與自身抗原結合形成免疫復合物，這些免疫復合物會導致滑膜增厚、充血、水腫[9]。檢測大鼠足腫脹度可以在一定程度上反映其類風濕關節炎的嚴重程度[10]。本研究發現，造模前各組大鼠足腫脹率無顯著性差異，造模后模型組與給藥組大鼠足腫脹率顯著高于空白對照組，使用大黃素治療后，各治療組大鼠足腫脹率顯著低于模型組。說明大黃素可以有效改善類風濕關節炎癥狀。

細胞因子主要可分為促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子兩種[11]。IL-1β、IL-6、TNF-α是兩種重要的促炎性細胞因子，主要由單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞和非免疫細胞等分泌，是炎癥的重要介導物質[12-14]。本研究結果表明，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高，使用大黃素干預后，大鼠血清上述炎癥因子含量顯著降低。說明大黃素可以有效降低大鼠體內的炎癥反應，這可能因為大黃素可以抑制NF/KB信號通路，抑制其下游的炎癥因子表達從而抑制類風濕關節炎大鼠體內炎癥反應。

關節細胞凋亡會加重類風濕關節炎的病情，目前關于凋亡相關基因研究較多，較為常見的是Bcl-2家族和Caspase家族蛋白，其中Bcl-2家族中Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡[15-16]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2表達下降時，Bax表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當Bcl-2表達升高，而Bax表達降低，則抑制細胞凋亡。本研究結果表明，模型組大鼠關節組織中HMGB1及Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，使用大黃素處理后關節組織中HMGB1及Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高。說明大黃素可以有效降低類風濕關節炎大鼠關節組織細胞的凋亡。

綜上，大黃素可以通過降低類風濕關節炎大鼠體內炎癥反應同時抑制關節組織細胞的凋亡，以緩解類風濕關節炎癥狀。在后續的實驗中將進一步增加大黃素的濃度梯度，并探討不同濃度大黃素通過相關信號通路對類風濕關節炎大鼠體內炎癥反應影響的作用機制。