響應曲面法優化金花葵中總黃酮超聲提取工藝研究

王苡瑄，殷 萌，韓穎妍，張小飛

(陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046)

金花葵(Aureahelianthus) 為草本錦葵科植物，被廣泛用于食品、保健品、觀賞等方面[1]。金花葵在《本草綱目》中記載其具有消炎鎮痛功效。現代藥理學研究證明，金花葵花中所含有的總黃酮具有諸如鎮痛、治療心腦血管疾病和抗炎等多種功效[2]。目前，金花葵總黃酮提取工藝有四種，分別為有機回流法[3]、微波提取法、超聲波提取法以及酶解法[4]。前期有多篇文獻報道花類藥材采用超聲波提取具有提取率高、環保無污染、提取效率快等優點，所以旨在單因素提取總黃酮的基礎上采用超聲提取方法[5]，對提取工藝作進一步優化。

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料與試劑

金花葵(河南省延津縣產，批號20180921)；蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司生產，純度>96%，批號20180719)；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 實驗儀器

UV-2600紫外分光光度計(北京京科瑞達科技有限公司生產)；AR1140分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司生產)；KQ-400KDE型高功率數控超聲清洗機(上海比朗儀器制造有限公司生產)；SHB-Ⅲ循環式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司生產)；DHG電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司生產)；RE5298A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠生產)。

2 實驗方法

2.1 標準對照液

精密稱取蘆丁標準品25 mg并將其加入到 100 mL容量瓶中，加入一定量的乙醇超聲溶解后定容，配置成標準對照液 (0.25 mg·mL-1)。

2.2 標準曲線的繪制

采用劉琦等人的方法繪制標準曲線[3]。測定不同濃度蘆丁溶液的吸光度繪制標準曲線。最終得標準曲線方程：Y=4.790 9X+0.038 9，R2=0.995 2。

2.3 樣品測定

金花葵總黃酮粗品制備：將粉碎后金花葵花10 g加入250 mL70%的乙醇超聲溶解，抽濾旋蒸即得，按2.2項方法測定其吸光度。

式中，C為金花葵總黃酮濃度(mg/mL)；V為樣品的體積(mL)；N為其總的稀釋倍數；M為加入的金花葵重量(g)。

2.4 單因素實驗

取金花葵粉末10 g于燒杯中，加乙醇溶解，倒入恒溫超聲提取機，超聲一定時間，抽濾、旋蒸，得金花葵總黃酮粗品。考察超聲功率、加入的乙醇濃度、物料比三個因素對其總黃酮含量的影響。

2.5 響應面實驗設計

分別以超聲功率(A)、加入的乙醇濃度(B)及金花葵總黃酮與乙醇溶液的物料比(C)作為考察因素，以金花葵花中總黃酮的含量為響應面值。實驗設計、響應曲面法因素編碼見表1。

表1 實驗因素水平及編碼Tab.1 Experimental factors level and coding

3 實驗結果與分析

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 超聲功率對總黃酮含量的影響

乙醇濃度選為70%、物料比為25∶1、提取溫度為10℃，超聲40 min，考察超聲功率對金花葵花中總黃酮含量的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同超聲功率對超聲提取的影響Fig.1 Influence of supersonic extraction of different ultrasonic power

由圖1可得，在200～700 W內總黃酮含量隨著功率增大而增大，而在700～800 W時隨著功率的增大金花葵花中總黃酮提取率逐漸減小。超聲功率達到700 W時，金花葵花中總黃酮提取率達到最大值，其隨著功率的升高，金花葵黃酮類物質被提取與分離得越多，可功率繼續增大到一定程度則會產生雜質而影響總黃酮的提取，所以確定最佳超聲功率為700 W。在響應面試驗中選擇超聲功率為600 W、700 W、800 W三個水平進行了響應面實驗。

3.1.2 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

超聲功率700 W、物料比為25∶1、提取溫度為10℃，超聲40 min，考察乙醇濃度對金花葵花中總黃酮含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同乙醇濃度對超聲提取的影響Fig.2 Influence of different ethanol concentration on supersonic extraction

由圖2可知，金花葵花中總黃酮提取的最佳乙醇濃度為70%。

3.1.3 物料比對總黃酮含量的影響

超聲功率700 W、乙醇濃度70%、提取溫度為10℃，超聲40 min，考察物料比對金花葵花中總黃酮含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同物料比對超聲提取的影響Fig.3 Influence of different materials ratio on ultrasonic extraction

由圖3可知，物料比15∶1～25∶1時，金花葵總黃酮物質含量隨物料比的增加而增加，當物料比大于25∶1時，總黃酮物質含量反而下降，這可能是因為黃酮與乙醇相似相溶，隨著乙醇添加量的增加兩者發生協同效應，有利于黃酮類物質溶出。當物料比為25∶1時，金花葵中的黃酮類物質幾乎全部溶出達到飽和，此后繼續增加乙醇添加量，可能使其他物質溶出，影響產品的純度。所以，在響應面試驗中選擇物料比為15∶1、25∶1、35∶1三個水平進行響應面優化的條件下，確定最終的最佳物料比為25∶1。

3.1.4 時間對總黃酮含量的影響

超聲功率700 W、物料比為25∶1、提取溫度為10℃，乙醇濃度為70%，考察超聲時間對金花葵藥材花中總黃酮含量的影響，結果如圖4所示。

圖4 不同時間對超聲提取的影響Fig.4 Influence of different time on ultrasonic extraction

由圖4可知，在提取時間20～40 min，金花葵花中總黃酮提取率逐漸增加，大于40 min后總黃酮提取率逐漸下降，這可能是因為提取時間過短，提取不徹底，金花葵中黃酮類物質無法完全析出導致含量低。隨著時間的延長，在剪切力作用下使得金花葵粉末更加細膩，增加了其溶出速度。但當超聲時間超過40 min后，可能其他雜質成分溶出增加，導致其含量下降。所以，確定最終最佳的提取時間為40 min。

3.2 響應面實驗結果及回歸分析

3.2.1 響應面實驗分析

結果見表2。

3.2.2 回歸模型的建立及其分析

運用Design-Expert 8.0.6.1軟件，對表2進行擬合后，得到自變量超聲功率(A)、乙醇濃度(B)、物料比(C)與因變量總黃酮物質含量(Y)的二次多項回歸方程為：

表2 超聲提取響應面實驗方案及結果Tab.2 Experiment and results of ultrasonic extraction response surface

Y=280.66+1.88A+9.08B+1.77C+2.71AB+0.21AC+4.80BC-11.83A2-37.51B2-17.47C2，檢驗結果見表3。

模型方差分析見表3，其中模型的均方差P=0.001 7<0.05，表明該模型顯著；失擬項P值為0.633 8，無失擬項。結果顯示，影響顯著(P<0.05)的因素有：B-濃度、A2 、B2 、C2，各因素的P值反映各因素對響應值的影響，P值越小，表明影響越大。

表3 響應面實驗方差分析及顯著性檢驗Tab.3 Analysis of variance and significance testing of response surface experiment

3.2.3 響應曲面分析與優化

響應曲面圖是在因變量為總黃酮物質含量的條件下各試驗因素交互作用后得到的結果[6-7]。由圖5～7可知，3個單因素影響順序為：乙醇濃度>超聲功率>物料比。

圖5 物料比與超聲功率交互作用Fig.5 Interactive function of materials ratio and ultrasonic power

圖6 物料比與乙醇濃度交互作用Fig.6 Interactive function of materials ratio and ethanol concentration

圖7 乙醇濃度與超聲功率交互作用Fig.7 Interactive function of ethanol concentration and ultrasonic power

3.2.4 最佳提取工藝確定及驗證試驗

經Design-Expert 8.0.6.1軟件計算分析，最佳工藝條件為：超聲功率為709.49 W、乙醇濃度為71.29%、物料比25.70∶1,在此條件下模型預測總黃酮物質含量為281.392 mg/g。采用3次工藝驗證其總黃酮含量為281.403 6 mg/g，驗證結果較好，說明所擬合的模型方程可以較好地反映金花葵總黃酮的提取過程。

4 結論

本實驗進行響應面優化篩選后,三個考察因素對金花葵中總黃酮物質含量影響的大小順序為∶ 提取溫度<功率<濃度。最佳工藝為超聲功率為709.49 W、乙醇濃度為71.29%、物料比為25.70∶1，3次平行驗證試驗的平均總黃酮物質含量為281.403 6 mg/g，該實驗為金花葵的提取及后續開發提供實驗基礎。