金匱腎氣丸對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的影響*

吳冬梅,潘開瑞

(1.河南省中醫院，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

腎臟組織中的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分的過度沉積造成腎纖維化幾乎是所有腎臟疾病的必經途徑[1-4]，也是腎臟疾病發展到終末期的重要病理表現。因此，積極探索抑制腎纖維化的藥物和治療方法對于治療腎臟疾病、延緩腎功能衰竭的進展有至關重要的作用。近年研究[5]表明,P38 MAPK信號通路在腎臟纖維化過程中起一定作用。金匱腎氣丸藥性平穩，建立在治療腎虛的腎氣丸的基礎上，具有良好的抗纖維化作用。本研究采用大鼠單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)制備腎纖維化模型，觀察金匱腎氣丸對大鼠腎間質纖維化的影響，探討金匱腎氣丸治療腎纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SD大鼠30只，SPF級，150～220 g，5～7周齡，由河南省實驗動物中心提供，批號為SCXK(豫)2015-0004，飼養于河南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗室[SCXK(豫)2011-0013]，室溫(22±2)℃，相對濕度 40%～60%，自由攝食飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

金匱腎氣丸，購自北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號15010639；吡非尼酮，購自西格瑪奧德里奇生化科技公司,批號Y0001769；Masson三色染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司，批號20180716；兔抗大鼠上皮鈣黏素(E-cadherin，批號ab233611)，Ⅲ型膠原(批號ab184993)、肌動蛋白α(alpha smooth muscle actin，α-SMA，批號ab5694)，均購自美國Abcam公司；SP免疫組化試劑盒(批號PV9003)、DAB顯色試劑盒(批號ZLI9017)，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(批號208054)、逆轉錄試劑盒(批號205311)、信使核糖核酸(RNA)提取試劑盒(批號74104)，均購自德國QIAGEN；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號A53225)，購自美國Pierce公司。其他試劑為國產分析純。CX31光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；凝膠電泳及轉膜系統、CHEMIDOC XRS+化學發光成像系統，均為美國Bio-Rad公司產品；ABI 7300熒光定量PCR儀，美國ABI公司產品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將30只大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、吡非尼酮組(100 μg/g)、金匱腎氣丸低劑量組(1.0 g/kg)、金匱腎氣丸高劑量組(2 g/kg)，每組6只。 按照董飛俠等[6]單側輸尿管結扎再通大鼠模型的建立方法制備模型。以 20 g/L戊巴比妥鈉按 2 μL/g 劑量麻醉大鼠，切開腹部，游離輸尿管，結扎左側輸尿管,建立UUO大鼠腎纖維化模型。假手術組對大鼠行腹部切口，游離輸尿管，不結扎，縫合。造模結束即灌胃給藥，各藥物組灌胃相應藥物，假手術組和模型對照組灌胃質量分數為5 g/L的羧甲基纖維素鈉,1 d 1次，連續 14 d。

1.4 檢測指標

末次給藥后 24 h，處死大鼠，取左側腎組織。

1.4.1 腎組織病理學表現

將腎組織置于40 g/L 的多聚甲醛組織固定液中室溫下固定 24 h，進行常規脫水，石蠟包埋，厚切片，行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，在200倍光學顯微鏡下觀察病理學表現。

1.4.2 腎間質損傷指數

腎組織處理方法同1.4.1。隨機選擇5個觀察視野，按腎間質損傷程度8項指標進行評分[7]，用Image Pro Plus 6.0計算平均值。

1.4.3 腎組織膠原含量表達

腎組織石蠟包埋，厚切片，在200倍光學顯微鏡下觀察其膠原程度。同時進行馬松三色染色(masson-trichrome staining，Masson)，切片。隨機選擇20個觀察視野，藍色為膠原纖維，用Image Pro Plus 6.0對 Masson 染色腎組織膠原含量進行灰度值分析，計算陽性表達占整個視野的百分比，取平均值。

1.4.4 腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達

采用免疫組織化學法檢測。按照SP免疫組化試劑盒說明書，檢測大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達情況。鏡下觀察棕褐色區域為陽性區域。隨機選取20個視野拍照，采用Image Pro Plus 6.0分析陽性面積百分比，取其平均值進行統計。

1.4.5 腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的mRNA表達

采用熒光定量PCR檢測。根據RNA提取試劑盒說明書提取100 mg腎臟組織的總RNA。查詢Genebank中大鼠Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的RNA序列，β-actin為內參，在CDS區設計引物。引物序列見表1。

表1 引物名稱及引物序列

按照逆轉錄試劑盒熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR反應。PCR反應總體積為20 μL，組分如下：RCR預混試劑 10 μL，上下游引物各0.5 μL，5倍稀釋的cDNA 1 μL，雙蒸水 8 μL。反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。結果用2-△△CT法分析統計相對基因表達量。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠腎組織病理學表現對比

HE染色顯示：假手術組腎組織病理形態學無明顯改變；模型對照組腎小管擴張明顯，間質內成纖維細胞顯著增生、膠原纖維表達增多；金匱腎氣丸低、高劑量組和吡非尼酮組的上述病變明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學表現對比(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠腎間質損傷指數對比

與假手術組對比，模型對照組的腎間質損傷指數增高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比,各藥物組腎間質損傷指數均降低(P<0.05)。 金匱腎氣丸高劑量組與吡非尼酮組之間腎間質損傷指數對比，差異無統計學意義，均低于金匱腎氣丸低劑量組(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠腎組織膠原含量表達對比

Masson染色顯示：模型對照組腎間質損傷嚴重，膠原增多；各藥物組的膠原表達有不同程度降低。見圖2。

表2 各組大鼠腎間質損傷指數對比

圖2 各組大鼠腎組織病理學表現對比(Masson染色，×200)

模型對照組腎間質膠原表達明顯高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)。吡非尼酮組和金匱腎氣丸低、高劑量組的膠原相對面積與模型對照組對比，差異有統計學意義 (P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎組織膠原相對面積對比

2.4 各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達對比

免疫組化圖片顯示：模型對照組大鼠腎組織呈棕褐色；假手術組免疫染色較弱,幾乎無淺棕色；藥物組膠原的表達從染色強度到面積均明顯減輕。見圖3。

定量分析結果顯示：與假手術組對比，模型對照組的Ⅲ型膠原和α-SMA的蛋白表達升高，上皮鈣黏素蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型對照組對比，3個藥物組的Ⅲ型膠原、α-SMA的蛋白表達均降低，上皮鈣黏素的蛋白表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

A. 假手術組：Ⅲ型膠原表達強度弱。 B. 模型對照組：Ⅲ型膠原表達強度明顯增加。 C.吡非尼酮組：Ⅲ型膠原表達較模型對照組減少。 D.金匱腎氣丸低劑量組：Ⅲ型膠原表達較模型對照組減少。 E.金匱腎氣丸高劑量組：Ⅲ型膠原表達較模型對照組減少。 F.假手術組：α-SMA表達強度弱。 G.模型對照組：α-SMA表達明顯增加。 H.吡非尼酮組：α-SMA表達較模型對照組減少。 I.金匱腎氣丸低劑量組：α-SMA表達較模型對照組減少。 J.金匱腎氣丸高劑量組：α-SMA表達較模型對照組減少。 K.假手術組：上皮鈣黏素表達強度高。 L.模型對照組：上皮鈣黏素表達明顯減少。 M.吡非尼酮組：上皮鈣黏素表達較模型對照組增多。 N.金匱腎氣丸低劑量組：上皮鈣黏素表達較模型對照組增多。 O.金匱腎氣丸高劑量組：上皮鈣黏素表達較模型對照組增多。

表4 各組大鼠腎組織III型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的蛋白表達對比 灰度值

2.5 各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的mRNA表達對比

與假手術組對比，模型對照組Ⅲ型膠原和α-SMA的mRNA升高，上皮鈣黏素的mRNA表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，3個藥物組的Ⅲ型膠原和α-SMA的mRNA表達降低，上皮鈣黏素的mRNA表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原、α-SMA和上皮鈣黏素的mRNA表達對比

3 討 論

絕大多數慢性腎病都會導致腎纖維化，炎癥是慢性腎病的基本病理表現，也是腎纖維化的啟動因素之一。在治療措施中，通常一類是針對原發腎病病因的治療，一類是針對腎纖維化的治療。目前在腎臟的多項病理參數中，腎小管萎縮和腎纖維化改變是判斷疾病發展、預后的重要因子[8]。吡非尼酮作為治療腎間質纖維化及局灶階段性腎小球硬化已用于Ⅳ期臨床，作為抗纖維化藥物，其可減弱纖維細胞中趨化因子2和趨化因子12的產生,其中抗氧化作用是治療纖維化的重要的機制之一。P38 MAPK信號通路的激活所導致的腎小管上皮細胞凋亡以及腎纖維化起到重要作用[9]。

目前有大量的中藥對腎纖維化影響的研究，從單味中藥、單體、提取物到傳統方、經驗方，以及成品藥，研究內容從基因水平、蛋白水平、代謝水平到細胞基質、信號通路、細胞因子、蛋白活性等。方、藥主要以活血化瘀、軟堅散結、補益正氣等為主。中醫藥治療腎纖維化、延緩病情進展有一定療效。金匱腎氣丸來源于《金匱要略》，是補益正氣、活血化瘀的代表方，是最早的補腎方劑。研究[10]顯示，金匱腎氣丸通過抑制單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、α-SMA、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ的表達來減輕腎間質纖維化。

本研究采用單側輸尿管梗阻方法制備UUO腎纖維化模型，以作用機制明確的吡非尼酮作為陽性對照藥物，觀察金匱腎氣丸對其腎間質纖維化的影響。結果顯示：金匱腎氣丸高劑量同吡非尼酮的療效相似，能有效改善腎小管上皮細胞的生長，抑制腎間質纖維的表達，減輕炎癥的發生，兩者差異無統計學意義；而低劑量雖有改善腎間質纖維化的作用，但效果不顯著。因此，應將金匱腎氣丸劑量優化納入處方的考量中。此外，金匱腎氣丸和吡非尼酮均可減輕腎臟纖維化，各藥物組的膠原面積明顯低于UUO模型對照組(P<0.05)，其中金匱腎氣丸高劑量組、吡非尼酮組的腎間質損傷指數較低，療效較好。金匱腎氣丸和吡非尼酮還可顯著下調E-cadherin、Ⅲ型膠原和α-SMA的表達水平。

綜上所述，金匱腎氣丸可有效減輕腎間質的損傷，減少膠原沉積，降低腎組織中的膠原蛋白的表達。作為中藥，金匱腎氣丸能通過有效保護腎間質，減輕膠原沉積來發揮治療腎間質纖維化的作用。