胃癌中FOXM1調控相關分子的表達及其臨床意義

錢建新，謝 峰，顧小強，于觀貞，陳 穎，衛立辛

FOXM1是FOX轉錄因子家族之一，其表達及轉錄激活需要多因子、多細胞信號通路的共同參與。FOXM1特異性表達在增殖期細胞中，在細胞終末分化時消失。FOXM1的表達水平與正常細胞的增殖、衰老及器官的形成過程密切相關，而其異常表達則會導致上皮間質轉化并通過影響基因組的穩定性及有絲分裂過程的進展等促進腫瘤的發生發展及轉移[1]。在胃癌中FOXM1通路亦存在泛化情況，該通路的活化及異常表達與胃癌患者的惡性生物學行為和不良預后密切相關[2-3]。本實驗在前期工作基礎上研究FOXM1改變前后FOXM1候選調控蛋白TWIST、ANXA1、SNAT1和S100A6的mRNA表達，應用組織芯片和免疫組化法研究差異顯著分子在135例胃癌和癌旁組織中的表達情況和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(1)實體標本材料：選取2001-2005年海軍軍醫大學附屬長海醫院病理科存檔的部分石蠟標本，共135例胃腺癌為實驗材料，病理診斷結果經2名病理醫師確認，其他類型如肉瘤、淋巴瘤等排除在外。所有患者均取得隨訪資料，隨訪方式主要是電話隨訪，最短隨訪期1年，最長者110個月。樣本的使用獲得患者知情同意和經海軍軍醫大學附屬長海醫院倫理委員會批準。(2)細胞：胃癌細胞SGC7901和BGC823購于中科院。(3)試劑：pcDNA3.1-FOXM1B和FOXM1-shRNA質粒由美國MD Anderson癌癥中心Suyun Huang教授贈送。FOXM1過表達(PSB1398，NM_202003)及FOXM1-shRNA敲減慢病毒(PLVT919)及對照慢病毒(NC，PLVT1)由上海生博生物醫藥科技有限公司包裝提供。Trizol(Invitrogen，15596-026)、M-MLV逆轉錄酶(M1705)和dNTP(U1240)購自PROMEGA公司。Oligo dT(B0205)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。SYBR Master Mixture(TAKARA，AK4202)。RNase -free的物品均購自Axygen。EnVision兩步法免疫組化試劑盒購自丹麥Dako公司(GK500705)，二甲苯和乙醇購自國藥集團，TWIST(H-81)兔多克隆抗體購于美國santa cruz，FOXM1(EPR17379)兔單克隆抗體購于英國Abcam公司，ANXA1兔多克隆抗體購于英國Abcam公司，S100A6兔多克隆抗體購于美國Proteintech公司。(4)引物：購于上海吉瑪制藥技術有限公司，序列見表1。(5)其他：1640培養基(Gibco，8116222)和胎牛血清(BI，1552680)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及穩定株構建 細胞計數后鋪6孔板，每孔10萬個細胞，培養條件為RPMI-1640加10%胎牛血清，12 h后按照MOI=60使用FOXM1敲減慢病毒和過表達慢病毒及相關對照病毒分別感染SGC7901及BGC823細胞，感染后24 h換液，繼續培養加嘌呤霉素篩選。傳代后，鋪6孔板，48 h后送樣檢測其敲減效率及Twist1、ANXA1、S100A6和SNAT1 mRNA的表達。

表1 FOXM1候選靶基因引物序列列表

1.2.2 RT-PCR 根據Invitrogen公司的Trizol法提取細胞中總RNA。Nanodrop測定所抽提RNA的濃度。根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行逆轉錄。將1 μl Oligo dT(0.5 μg/μl)和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，補充DEPC-H2O至9 μl。混勻后離心70 ℃溫浴10 min。在每個反應管中加入的11 μl的M-MLV RT反應液，RT反應在42 ℃進行1 h后完成，之后用70 ℃處理10 min使RT酶失活。得到的RT反應產物cDNA用于PCR。RT-PCR設定程序為兩步法Real-Time定量。預變性95 ℃、15 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，45個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結束后，在95 ℃變性1 min。然后冷卻至55 ℃，使DNA雙鏈充分結合。從55 ℃開始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持4 s，同時讀取吸光值。以β-actin作為內參。

1.2.3 組織芯片構建 根據蘇木精-伊紅(HE)染色切片選取存檔組織蠟塊，再用HE染色的切片確定具有代表性的病變部位(癌和癌旁)，然后參照Kononen等建立的方法應用組織芯片構建儀(Beecher Instruments，Silver Spring，MD)制備組織芯片。

1.2.4 免疫組織化學染色 采用EnVision二步法(丹麥Dako公司試劑盒)按說明書操作。用pH 9.0的檸檬酸鹽緩沖液修復。常規石蠟包埋，4 μmol/L連續切片。滴加50～100 μl按比例稀釋后的一抗∶50；BHLHA38; BOSTER Biological Technology company, Wuhan, China)，FOXM1(1∶100；K19; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA)，ANXA1(1∶100；ab33061, Abcam Company, Cambridge, UK)，S100A6(1∶50；5B10；BOSTER Biological Technology company, Wuhan, China)，用PBS替代一抗作陰性對照。

1.2.5 染色評估 四者性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞核或者細胞漿內。采用二級計分法，陽性細胞計分標準為：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度分級計分標準為：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐或棕褐色為3分。2者計分相乘≥1者為陽性。

1.3 統計學處理

所有數據均采用SPSS 21.0軟件作統計處理。組內變量采用卡方檢驗，單因素生存曲線用Kaplan-Meier，多因素生存分析用Cox regression。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩定轉染細胞株的鑒定

復蘇凍存的構建好的FOXM1過表達細胞株BGC823-FOXM1和BGC823-NC，FOXM1敲降的細胞株SGC7901-FOXM1-shRNA和SGC7901-NC[2]。通過免疫熒光和RT-PCR檢測轉染效率，免疫熒光顯示轉染效率較高(圖1)，RT-PCR顯示過表達FOXM1的過表達率是對照組的5倍，而敲除FOXM1的敲減率也是對照組的5倍左右(圖2)。

注：IF為免疫熒光，NC為對照組圖1 穩定轉染細胞株的鑒定(IF×200)

注：與NC組比較aP<0.01。NC為對照組圖2 轉染細胞株中FOXM1的表達情況

2.2 FOXM1對TWIST、ANXA1和S100A6的調控作用

如圖3所示，胃癌SGC7901細胞中下調FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6、SNAT1表達顯著下調(P<0.05)，而BGC823細胞中上調FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6表達顯著上調(P<0.05)，提示FOXM1能夠轉錄調控TWIST1、ANXA1和S100A6在胃癌細胞中的表達。

注：NC為對照組。胃癌SGC7901細胞中下調FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6、SNAT1表達顯著下調(與FOXM1下調前比aP<0.05)，而BGC823細胞中上調FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6表達顯著上調(與FOXM1下調前比bP<0.05)圖3 FOXM1對TWIST、ANXA1和S100A6的調控情況

2.3 FOXM1、TWIST、ANXA1和S100A6在胃癌組織及非癌組織中的表達

構建3張組織芯片，其中脫落15位點，用常規切片補充。癌組織中FOXM1、TWIST、ANXA1和S100A6，染色陽性細胞分布呈灶性或彌漫染色，非癌組織中陽性細胞呈散在或片狀分布，且染色強度均弱于癌組織(圖4)，在腫瘤組織中3者表達率分別為56.3%、49.6%、58.5%和63.7%，而在癌旁非腫瘤組織中的表達率分別為22.2%、26.0%、37.0%和18.5%，4者在癌組織中表達顯著高于癌旁非腫瘤組織中的表達(P<0.01)。

注：A為FOXM1，B為S100A6，C為TWIST，D為ANXA1。A、B、C、D左側免疫組化×4，右側免疫組化×200；A、B、C、D右上圖為胃癌，右下圖為癌旁組織圖4 利用免疫組織化學技術檢測胃癌和癌旁組織中FOXM1、S100A6、TWIST1和ANXA1表達

2.4 FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6表達與胃癌臨床病理參數的關系

FOXM1的過度表達與淋巴結轉移密切相關，ANXA1的過度表達與腫瘤浸潤、淋巴結轉移和疾病進展密切相關，S100A6與胃壁浸潤密切相關，而TWIST1與腫瘤浸潤、淋巴結轉移、疾病進展以及分化差密切相關，詳見表2。

2.5 胃癌組織中FOXM1等相關因子表達對患者預后的影響

單因素生存分析顯示FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6的表達均與胃癌患者預后相關(圖5)，陽性表達FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6的胃癌患者在的中位生存期分別為71、72、72、72個月，而陰性表達者的生存期分別為51、51、48、53個月，陽性表達者和陰性表達者之間統計學差異顯著(表3)。

表2 胃癌患者樣本各指標陽性統計結果

圖5 FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6的表達與胃癌患者預后之間的關系

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人體健康和浪費社會資源。日本胃癌死亡率逐步下降，美國非西班牙裔白人中發病率也呈下降趨勢[4]。

隨著研究手段的改進和資金投入，我國在胃癌的早期診斷、新型高效生物標志物的發現以及基于生物標志物或靶向治療藥物的開發等方面取得了巨大發展[5]。然而，中國胃癌的發病率和死亡率一直居高不下。繼續研究胃癌的發病機制、尋找預測胃癌患者預后和作為治療靶點的標志物，至關重要。

FOXM1是FOX轉錄因子家族之一，在腫瘤中的過表達促進腫瘤的發生發展及轉移[6-7]。FOXM1的表達水平將為腫瘤診斷、評估、預后等提供一個重要指標，而FOXM1本身有望成為新藥開發及腫瘤治療的一個潛在靶點[8-9]。筆者前期研究發現FOXM1的過表達促進胃癌細胞增殖和腫瘤形成，而且其高表達提示胃癌患者預后不良。進一步研究發現FOXM1能夠調控多個基因的表達，譬如ADAM17、PDGF、ANXA1和TWIST等[2，10-12]，提示FOXM1是一個重要的轉錄因子，但這些表達調控未形成系統性的研究。為了深入研究FOXM1的調控機制，筆者利用構建好的過表達FOXM1和敲降FOXM1胃癌細胞[2]，檢測了其候選靶基因(TWIST1、ANXA1、S100A6和SNAT1)的表達，這新基因啟動子區具有FOXM1結合位點，且均與腫瘤進展密切相關。

表3 135例胃癌患者的生存分析

本研究發現FOXM1的敲降表達引起TWIST1、ANXA1、S100A6和SNAT1的表達下降，而過表達FOXM1則致使TWIST1、ANXA1和S100A6的表達升高，但SNAT1表達升高并不明顯，提示SNAT1不是FOXM1的直接調控因子。膜聯蛋白(annexins)是一類鈣依賴的磷脂結合蛋白超家族，參與抗炎癥反應、細胞分化和增殖及腫瘤發生等細胞生命活動[13-15]。ANXA1作用機制非常復雜，在不同條件下呈現出抑癌基因和促癌基因雙向功能[16-17]。本研究顯示ANXA1與胃癌的轉移和疾病進展高度相關，且受到FOXM1的調控，該研究與膠質瘤中的研究結果一致，FOXM1直接調控ANXA1的表達[12]。上述研究證明了ANXA1是FOXM1的下游靶基因，在胃癌中FOXM1-ANXA1軸也發揮了促腫瘤發生和促轉移的作用。S100蛋白家族是一個鈣結合蛋白家族，參與細胞周期活動、細胞分化、腫瘤生長以及細胞外基質分泌活動等過程[18-19]。S100蛋白家族成員S100A6在腫瘤中表達異常，并與腫瘤的增殖、浸潤轉移和凋亡密切相關。既往研究顯示S100A6在胃癌細胞中表達升高，其過表達促進了腫瘤細胞增殖[20]。本研究同樣顯示S100A6在胃癌組織中表達升高，與胃癌的侵犯深度和分化不良相關，多因素分析顯示S100A6是胃癌患者的獨立預后因子。既往有研究也支持這一發現，胃癌患者血清S100A6水平明顯高于健康對照組，與淋巴結轉移、TNM分期、會陰浸潤及血管浸潤顯著相關，血清S100A6水平是總體生存率的獨立預測因子[21]。本研究再次證實了S100A6在胃癌發生發展中的重要性，同時首先報道了S100A6受到FOXM1的調控，然而FOXM1是如何調節S100A6的表達的，還需要進一步研究。上皮-間質轉變(EMT)是腫瘤轉移進程中的一個重要過程， TWIST1是EMT過程中重要的調控因子[22]。本研究顯示TWIST1的高表達與胃癌侵犯深度、淋巴結轉移、疾病進展和不良分化相關。而TWIST1在胃癌中的過表達受到FOXM1的調控，該研究與筆者前期發現一致，FOXM1在胃癌細胞中可以上調TWIST1促進胃癌細胞增殖[11]。本研究進一步表明FOXM1-TWIST1也參與了胃癌的侵襲轉移。

判斷胃癌患者預后的因素包括臨床病理因素和分子生物學指標[23]。既往大量研究引入了許多分子生物學標志物，如磷酸化mTOR、HER2、PCDH9、ADAM17和FOXM1等，來協助TNM分期指導胃癌患者的預后[2，23-25]。本研究中亦檢測了FOXM1調控的ANXA1、S100A6和TWIST1 3個下游靶基因與胃癌患者預后的關系，單因素生存分析均顯示4者與胃癌患者的不良預后相關。但是臨床因素如胃壁侵犯、淋巴結轉移和疾病分期在小樣本量上是判斷胃癌患者的獨立因子，提示胃癌患者的早期發現是根治胃癌和提高胃癌患者生存期的根本因素。

本研究通過細胞學和免疫組化證實了胃癌組織中FOXM1、ANXA1、S100A6和TWIST1表達升高，且與胃癌惡性生物學行為高度相關。FOXM1介導的信號通路泛化激活在胃癌發生發展中起了重要作用，靶向FOXM1有望抑制下游靶基因的泛化。因此FOXM1介導的信號通路不單單有望成為預測胃癌轉移和預后的腫瘤標志物，其本身更有望成為潛在治療靶點。