水飛薊素調(diào)控信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子3逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥性的研究

袁修翠，劉曙光

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，我國每年女性乳腺癌發(fā)病16.9萬例，是女性第二大常見惡性腫瘤。在我國，約有4.5萬女性死于乳腺癌，在惡性腫瘤引發(fā)的死亡中排第六位[1]。乳腺癌是實體瘤中應(yīng)用化療最有效的腫瘤之一，但由于多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)現(xiàn)象的存在往往會造成化療的失敗，降低了抗癌藥物的臨床療效[2]。克服MDR 的方法之一是使用逆轉(zhuǎn)劑，但是逆轉(zhuǎn)劑的生物利用率低或易引發(fā)嚴重的不良反應(yīng)，導(dǎo)致其在臨床上的應(yīng)用舉步維艱[3]，因此尋找高效、低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前乳腺癌治療的研究熱點。

目前，越來越多的證據(jù)顯示信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和乳腺癌的MDR密切相關(guān)[4]。因此，本實驗探究了水飛薊素(Silibinin)是否可通過調(diào)控STAT3來調(diào)控乳腺癌耐藥性。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰蛋白酶劑購自美國BI公司，人乳腺癌細胞株MCF-7購自中科院上海細胞庫，MCF-7/ MDR 細胞購自中南大學(xué)高等研究中心；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁生物公司；總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及QPCR試劑盒購自康為試劑；阿霉素和水飛薊素購自深圳萬樂藥業(yè)；STAT3和p-STAT3(Ser727)一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 一抗購自Proteintech公司；二抗購自中杉金橋；流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；STAT3-siRNA和過表達質(zhì)粒均購自美國Origene公司。水飛薊素干粉先用DMSO 溶解為500mg/ml 的工作母液(DMSO 在無毒劑量內(nèi))，分裝后避光保存于-20 ℃冰箱，使用時用培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度應(yīng)用液。

1.2 細胞培養(yǎng) 將乳腺癌細胞株MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2含量為5%的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。相應(yīng)耐藥株MCF-7/MDR連續(xù)培養(yǎng)在含1.0 μg/ml的阿霉素的上述培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件相同。

1.3 細胞內(nèi)總RNA的提取和實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-QPCR) 按照康為試劑RNA提取試劑盒說明書進行細胞內(nèi)總RNA的提取，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照相應(yīng)的說明在冰上進行操作。RT-QPCR用來檢測細胞和組織內(nèi)STAT3的表達。反應(yīng)條件：94 ℃，60 s，熱變性：90 ℃，15 s，60 ℃，60 s，循環(huán)擴增40次；最后進行溶解曲線分析。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，產(chǎn)物根據(jù)溶解曲線進行分析，以排除是否有引物二聚體的干擾。以達到閾值的最低循環(huán)數(shù)(Ct值)計算樣本中的mRNA的相對量。以GAPDH作為內(nèi)參，計算作為樣本中的相對表達豐度，用2-△△Ct方法計算STAT3在結(jié)腸癌細胞中的表達，引物序列為：STAT3： 5’-AGCAGCACCTTCAGGATGTC-3’(forward)，5’- GCATCTTCTGCCTGGTCACT-3’ (reverse)；GAPDH，5’-TTGCCCTCAACGACCACTTT-3’(forward)，5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ (reverse)。

1.4 Western Blotting檢測STAT3、p-STAT3 蛋白表達 利用RIPA裂解液提取MCF-7及MCF-7 /MDR 細胞內(nèi)的總蛋白，并用BCA法對蛋白進行定量，后將其置于100 ℃金屬浴中孵育8 min進行蛋白變性。每個樣品取20 μg行SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)膜，剪下含目的條帶的PVDF 膜，置于含5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，STAT3、p-STAT3、GAPDH 一抗4 ℃過夜孵育相應(yīng)條帶。TBST清洗3次，室溫孵育二抗1 h，TBST清洗3次，ECL顯色，膠片曝光。凝膠成像系統(tǒng)掃描后Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 CCK-8檢測細胞毒性 (1)取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA和STAT 3過表達的MCF-7/MDR細胞，按2×105/孔的密度接種于96孔板中，每個孔中加入100 μl 1640完全培養(yǎng)基，每個處理組設(shè)置5個復(fù)孔。(2)24 h 后加入不同濃度的阿霉素(耐藥株終濃度分別為1、5、10、25、50、100 μg/ml，親本細胞株終濃度分別為0.2、0.8、2、5、10、20 g/ml)，以未加阿霉素處理的細胞為對照組，藥物處理48 h 后棄去培養(yǎng)基，然后用PBS緩沖液清洗3次，再在每孔加入100 μl的CCK8反應(yīng)液(90 μl培養(yǎng)基+10 μl CCK8工作液)，隨后將96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3小時，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光值。計算阿霉素對耐藥細胞的半數(shù)抑制量IC50。實驗平行重復(fù)3次。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 Annexin V/PI雙染法檢測水飛薊素和STAT3對各組細胞凋亡的影響。胰酶消化各組細胞并收集，用冷的PBS將其洗滌2次，500 μl binding buffer重懸細胞，向細胞懸液中加入5 μl Annexin V，室溫孵育15 min，隨后加入5 μl PI溶液，孵育5 min后于流式細胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的方式表示，組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗(雙側(cè)檢驗)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3在MCF-7/MDR耐藥株中高表達 Western Blotting和QPCR實驗結(jié)果顯示，乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR中STAT3的蛋白水平和mRNA水平均較親本細胞株MCF-7顯著上升，見圖1。

注：a為Western Blotting檢測MCF-7和MCF-7/MDR中STAT3的表達；b為QPCR檢測MCF-7和MCF-7/MDR中STAT3的表達圖1 Western Blotting和QPCR檢測MCF-7和MCF-7/MDR中STAT3的表達

2.2 STAT3增強乳腺癌親本細胞株MCF-7的耐藥性并抑制其凋亡 CCK-8和流式細胞凋亡術(shù)結(jié)果顯示，同對照組相比，過表達STAT3后MCF-7細胞的IC50明顯提高(圖2a)，凋亡能力顯著抑制(圖2b)；Western Blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3顯著降低了乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR中STAT3的表達水平，其敲除效率可達75% (2c)；CCK-8和流式細胞凋亡術(shù)結(jié)果顯示，同對照組相比，下調(diào)STAT3后MCF-7/MDR細胞的IC50值顯著降低(圖2d)，凋亡能力顯著增強(圖2e)。

2.3 水飛薊素逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR的耐藥性并促進其凋亡 乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR加入水飛薊素48 h后收蛋白檢測了水飛薊素對STAT3表達的影響，Western Blotting結(jié)果顯示水飛薊素處理后STAT3的表達顯著降低(圖3a)；CCK-8和流式細胞凋亡術(shù)結(jié)果顯示，同對照組相比，加入水飛薊素后IC50值顯著降低(圖3b)，凋亡能力顯著增強(圖3c)。

注：a為CCK-8檢測過表達STAT3后MCF-7的細胞毒性曲線及IC50；b為流式細胞凋亡術(shù)檢測過表達STAT3后MCF-7細胞的凋亡情況；c為Western Blotting檢測了STAT3的敲除效率；d為CCK-8檢測敲除STAT3后MCF-7/MDR的細胞毒性曲線及IC50；e為流式細胞凋亡術(shù)檢測敲除STAT3后MCF-7/MDR細胞的凋亡情況。MCF-7/MDR阿霉素終濃度分別為1、5、10、25、50、100 μg/ml，MCF-7阿霉素終濃度分別為0.2、0.8、2、5、10、20 μg/ml圖2 STAT3增強乳腺癌親本細胞株MCF-7的耐藥性并抑制其凋亡

注：a、b為CCK-8檢測加入水飛薊素(10 μg/ml)后MCF-7/MDR的細胞毒性曲線及IC50；c為流式細胞凋亡術(shù)檢測加入水飛薊素(10 μg/ml)后MCF-7/MDR細胞的凋亡情況圖3 水飛薊素逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR的耐藥性并促進其凋亡

注：a為CCK-8檢測不同處理組MCF-7/MDR的細胞毒性曲線及IC50；b為流式細胞凋亡術(shù)檢測不同處理組MCF-7/MDR細胞的凋亡情況。STAT3-OE-NC為過表達STAT3對照組，STAT3-OE為過表達STAT3組，si-STAT3-NC為siRNA-STAT3對照組圖4 水飛薊素可通過調(diào)控STAT3的表達逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥性并促進其凋亡

2.4 水飛薊素可通過調(diào)控STAT3的表達逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥性并促進其凋亡 CCK-8和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，同只加水飛薊素組相比，加入水飛薊素同時過表達STAT3組MCF-7/MDR細胞的IC50值顯著增大；只敲除STAT3組和既加入水飛薊素又敲除STAT3組相比IC50值無顯著性差異，較對照組均顯著降低(圖4a)；凋亡結(jié)果顯示，同只加水飛薊素組相比，加入水飛薊素同時過表達STAT3組凋亡能力顯著降低，只敲除STAT3組和既加入水飛薊素又敲除STAT3組相比凋亡情況無顯著性差異，較對照組均顯著增增強(圖4b)。

3 討論

水飛薊素是從菊科藥用植物水飛薊的種皮中提取出來的一種黃酮木脂素類化合物，主要成分是水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等黃酮類物質(zhì)。研究表明其具有促進膽汁分泌和消炎、保護肝臟、強抗氧化等作用[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素不僅可抑制乳腺癌，還可以逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥[6]，并呈現(xiàn)出多步驟、多靶點、全方位特點，增強機體細胞免疫功能，適合用于臨床抗腫瘤藥物的研發(fā)。但目前對于水飛薊素逆轉(zhuǎn)乳腺癌的多藥耐藥性的具體分子機制鮮有報道。本研究從水飛薊素發(fā)揮作用的具體機制進行了較為深入的探究，研究結(jié)果顯示，水飛薊素可降低乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR對阿霉素的IC50值，促進細胞凋亡。

STAT3是存在于細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，可通過與酪氨酸磷酸化通道相偶聯(lián)而被激活。磷酸化的STAT3 以二聚體形式并被轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)并參與下游基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控[7]。STAT3作為一種原癌基因，可調(diào)控Bcl-XL、Bcl-2、C-myc等與細胞增殖、凋亡密切相關(guān)的基因，進而促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[8]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 在乳腺癌組織中的異常激活是導(dǎo)致其產(chǎn)生化療耐藥的關(guān)鍵因素[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌耐藥株MCF-7/MDR中STAT3的表達顯著多于乳腺癌親本細胞株MCF-7；STAT3可增加IC50值，抑制細胞凋亡。且同只加水飛薊素組相比，加入水飛薊素同時過表達STAT3組IC50值顯著增大，凋亡受到明顯抑制，si-STAT3組同水飛薊素+si-STAT3組相比IC50值無顯著性差異。以上結(jié)果均表明水飛薊素可通過降低STAT3的表達逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥性。