丁苯酞注射液對腦缺血再灌注線粒體損傷過程的保護機制研究

顏秀麗， 裴兵兵

腦血管疾病是一種嚴重危害人類身體健康的疾病，一直以來以高死亡率、致殘率和難以預見等特點受到國內外醫學界的廣泛關注。而卒中也成為全球范圍內死亡的第二大原因[1～3]。其中缺血性卒中只有r-tPA及機械血栓切除術在臨床上真正被證明有效并得到了廣泛共識，但無論是r-tPA還是機械血栓清除術有效率都較低，且伴隨的風險很大。一些臨床資料表明患者通過化學或機械方法，雖然恢復了腦血流供應但并沒有使病情得到預期的恢復或者提高[4]。這種治療失敗，甚至導致病情惡化的情況在臨床上并不少見，現階段認為缺血再灌注損傷是導致此種情況的主要的病理生理過程。線粒體是細胞能量代謝的主要場所，因此對線粒體代謝的研究可能為我們提供治療的新靶點。本課題組在前期工作中通過線粒體PCR Array方法，分析了缺血再灌注損傷對線粒體能量代謝相關基因的影響，并深入研究丁苯酞注射液對于線粒體代謝相關基因的調節作用，根據前期的實驗結果，選擇了細胞色素C氧化酶A2(cytochrome c oxidaseⅥ A2，COX6A2)，煙酰胺核苷酸轉移酶(nicotinamide nucleotide transhydrogenase，NNT )，解偶聯蛋白3 ( uncoupling protein3，UCP3)三種線粒體蛋白作為研究靶點，以進一步明確丁苯酞注射液(Butylphthalide，NBP)在缺血再灌注損傷過程中是否通過調節上述三種蛋白進而對線粒體起到保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，由遼寧長生生物技術有限公司提供。

1.1.2 試劑 A4級大鼠線栓購自北京西濃科技有限公司；水合氯醛購自北京化工廠；2，3，5氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC) 購自鼎國昌盛生物技術有限公司；VDAC1一抗購自美國Abcam公司；COX6A2、NNT、UCP3一抗購自美國Abcam公司；線粒體分離試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；預染蛋白分子Marker購自北京博奧森生物科技有限公司；實驗用丁苯酞原液購自石藥集團。

1.1.3 儀器 手術器械(包括止血鉗、眼科鑷、眼科剪、顯微外科鑷、可吸收縫合線、持針器等)；大鼠用腦切片槽購自美國Alto公司；蛋白電泳購自美國Bio-Rad公司；Western-blot跑膠裝置、電源購自北京百晶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 動物篩選及分組 大鼠體重在250～280 g之間，隨機分籠，遵照大鼠標準飼養方式喂養，墊料及鼠糧由吉林大學動物中心提供，大鼠采取自由進食及飲水。隨機分為3組(每組6只)：(1)Sham組：大鼠僅暴露左側頸總動脈后，正常縫合表皮。(2)模型組(MCAO組)：運用改良經典線栓法，制備大鼠MCAO模型，缺血1.5 h后拔出線栓，再灌注24 h后處死。(3)NBP組(NBP+MCAO組)：運用改良經典線栓法，制備大鼠MCAO模型，于缺血1 h給予80 mg/kg NBP腹腔注射，缺血1.5 h后拔出線栓，再灌注24 h后處死。

1.2.2 大鼠模型制備 采用改良的經典線栓法，10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉，固定大鼠，沿氣管方向縱向切開，暴露左頸總動脈游離頸內及頸外動脈，動脈夾暫時夾閉頸總動脈及頸內動脈，于頸外動脈將栓塞線插入頸內動脈，直至栓塞線至大腦中動脈中深度(約1.8±0.3 cm)，打開置于頸內動脈上的活結及頸總動脈上的動脈夾，縫合切口。缺血1.5 h后，取出栓塞線并在切口下方打結。逐層縫合傷口，放于室溫環境中觀察，待大鼠完全蘇醒后送回飼養室，再灌注24 h。

1.2.3 神經功能評分 待大鼠完全清醒后，運用改良Garcia評分法[5]評價大鼠神經功能。

1.2.4 Western blot檢測蛋白水平表達

1.2.4.1 腦組織樣本制備 快速斷頭取腦后，在冰盒上剝離大鼠梗死側大腦皮質，裝入事先編號的EP管內，放入液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4.2 線粒體蛋白的提取 稱取150 mg新鮮大鼠腦組織，洗凈血水后，用濾吸干后將腦組織剪碎后放入玻璃勻漿器內冰上研磨組織20次左右。離心，上清液取出，再次離心10 min。取上清，4 ℃，12000 r/min，離心15 min。離心后的EP管內液體，上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白，沉淀物為線粒體。取沉淀再次洗滌離心，棄掉上清，提純線粒體。重懸線粒體沉淀，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 染色 術后24 h用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，于冰板上快速斷頭取腦。將腦組織置于-20 ℃冰箱中15 min，取出后腦組織置于腦切片槽內，以2 mm為間隔做冠狀切片，共切5片。切好后置于1%TTC磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)中，放入37 ℃避光孵箱中靜置15 min后取出翻面，再等待15 min。染色完成后分別對兩面進行圖片采集，圖片采用Image J圖像分析系統計算梗死體積。梗死體積百分比(%)=梗死區腦的體積/大腦的體積×100%。

1.2.6 蛋白免疫印記(Western blot)法檢測COX6A2、NNT、UCP3蛋白的表達 用蛋白裂解液將腦組織制備成勻漿液，在4 ℃ 低溫12000 r/min 離心30 min，取上清液備用。BCA法定量總蛋白質濃度，將各組蛋白濃度調到同一水平。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，加蛋白樣品，電泳后通過濕轉將蛋白轉到PVDF 膜。5%脫脂奶粉TBST 緩沖液洗膜15 min，一抗4 ℃下孵育過夜后TBST 洗膜3次，加入二抗后孵1.5 h，TBST洗3次后加入顯色劑ECL 1 min 后，暗室顯影2 min洗膠片，掃描各免疫印記條帶并進行分析。

2 結 果

2.1 大鼠神經功能評分及梗死體積 通過綜合改良Garcia評分法可以看出，Sham組大鼠神經功能基本正常，與MCAO組(5.60±0.51)相比，NBP組(10.60±0.81)，大鼠的神經功能都得到了一定的改善(P<0.05)。

如圖1所示，通過Image J軟件分析可以看出MCAO組梗死體積百分比為(27.92±1.31)，NBP組為(21.72±1.10)，梗死體積明顯減小(P<0.05)。

2.2 Western blot檢測NBP對腦缺血再灌注損傷后COX6A2、NNT、UCP3蛋白表達水平的影響 如圖2所示，與Sham組相比，MCAO組的COX6A2表達明顯增高(P<0.05)，而應用NBP后，這種增高得到了明顯的抑制(P<0.05)；與Sham組相比，MCAO組的NNT蛋白在線粒體內表達明顯下降(P<0.05)，而應用NBP后，這種下降得到了明顯的抑制(P<0.05)；與Sham組相比，MCAO組的UCP3蛋白表達明顯增高(P<0.05)，而應用NBP后，這種增高得到了明顯的抑制(P<0.05)。

圖1 TTC染色、梗死體積百分比及神經功能評分

圖2 Western blot檢測大鼠皮質缺血區線粒體COX6A2、NNT、UCP3蛋白表達情況

3 討 論

腦缺血再灌注損傷的機制復雜，涉及氧化應激、炎癥反應、細胞內鈣超載、內質網應激和神經細胞凋亡、自噬等。本研究中采用組織染色，神經功能評價及檢測蛋白表達水平，證明了NBP可以減少腦缺血再灌注損傷，這種保護作用機制之一是通過調節線粒體代謝途徑實現的。本實驗中COX6A2、NNT、UCP3三種蛋白皆是線粒體表達蛋白，且在缺血再灌注損傷中對線粒體代謝起到調節作用。

細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，CcO)是線粒體電子傳遞鏈的末端酶復合物，哺乳動物中CcO是一種異質寡聚蛋白復合物，由13個亞基組成，線粒體基因和核基因共同編碼。COX6A是細胞色素C氧化酶的核編碼亞基之一，該亞基由不同基因編碼分為兩種亞型，其中COX6A1(COX6AL)表達在非肌肉組織內，COX6A2(COX6AH)僅表達于橫紋肌中[6]，在一定條件下，細胞可通過過度表達COX6A2以補充COX6A1的缺乏[7]。COX6A參與CcO最后階段的組裝，有研究表明，COX6A參與維持CcO二聚體狀態的穩定，并構成了細胞色素C的作用位點[8，9]，在功能復合物 IV 的表達和酶活性中起著重要的作用[7]。COX6A2可以通過結合ADP進而導致CcO催化活性的增加，且這種增強可以通過單克隆抗體的競爭而消除[10]，并在線粒體活性氧代謝的過程中發揮作用[11]。同樣，本研究中COX6A2蛋白在缺血再灌注損傷中表達明顯增高，線粒體內ATP/ADP比率增高，降低質子泵容量，下調線粒體膜電位，使線粒體通透性增大，過量的細胞色素C釋放入胞漿，進而細胞發生凋亡。NBP通過抑制COX6A2蛋白的表達，從而減少神經細胞在缺血再灌注損傷中的凋亡。

NNT是一種由核基因編碼的蛋白，主要位于線粒體內膜中[12]。NNT通過結構變化參與線粒體及胞漿的質子轉移過程[13]，維持線粒體膜電位、活性氧的動態平衡及能量產生，是保護線粒體功能和細胞生存的重要酶。有研究表明，病理生理條件下，質子與NNT結合，可以催化還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)及煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)等[14]，且二者是代謝的重要輔酶，在生物合成和氧化還原穩態過程中起著電子載體的作用，是細胞內抗氧化防御系統的重要組成之一，在防御活性氧損傷方面起著非常重要的作用。有研究結果表明，在慢性心肌缺血模型中，NNT表達含量降低，這與我們現有結果一致[15]。我們認為在氧化應激損傷中，線粒體能量代謝蛋白含量下降，細胞內抗氧化能力降低，細胞損傷加重。這提示我們NNT是一個潛在的治療靶點，可以改善神經元氧化應激條件下的氧化還原平衡。NBP可以通過增加NNT蛋白的表達進而保證線粒體質子泵活性，穩定線粒體結構和功能，降低氧化應激對神經細胞的損傷。

UCP3是線粒體載體蛋白家族的重要成員之一，主要分布在骨骼肌線粒體膜，可引起線粒體膜質子漏增加，降低質子梯度，ATP 合成效率下降，呼吸鏈氧化和磷酸化解偶聯，并以熱能的形式釋放能量。在本課題組前期對線粒體代謝蛋白的研究中表明，該蛋白亦存在于腦組織中，且在缺血再灌注損傷中占據著重要的地位。有研究表明UCP3參與解偶聯過程[16]，調節線粒體活性氧的生成[17]，調節能量及脂質代謝[18]，影響線粒體鈣離子轉運[19]。上述過程是腦缺血再灌注損傷的重要病理生理過程，因此UCP3蛋白參與腦缺血再灌注損傷的調節，為治療提供新的靶點。

綜上，腦缺血再灌注損傷過程中線粒體地位至關重要，而線粒體代謝相關蛋白結構及功能繁雜交錯，本實驗以前期工作中篩查的變化顯著的基因表達蛋白為研究對象，從蛋白水平證明了其與腦缺血再灌注損傷的重要關系，為下一步深入機制研究提供了很好的開端，同時，探究了NBP的線粒體保護相關途徑，擴展了其保護機制的相關研究。