頸動脈粥樣硬化斑塊的非標記定量蛋白質組學研究

鄒 璇， 王 辰， 劉一靜， 施銘崗， 安中平， 黃慧玲， 周官恩

頸動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的危險因素之一。動脈粥樣硬化研究表明，不穩(wěn)定斑塊即使不引起嚴重的動脈狹窄，也會造成不同程度的缺血性腦卒中。與動脈狹窄比較，斑塊本身成分及穩(wěn)定性與缺血性腦血管事件密切相關，因此，不穩(wěn)定性斑塊檢測、影響因素及治療方法的選擇具有重要意義[1]。由于受手術標本的限制，有關頸動脈粥樣硬化斑塊的蛋白質組學研究尚少。本研究試圖建立頸動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊的表達圖譜，進行差異蛋白質組學分析，鑒定出差異表達蛋白，尋找對頸動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊診斷有特異性和敏感性的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組

1.1.1 納入標準 ①臨床診斷明確的新發(fā)急性缺血性卒中患者；②年齡>18歲(本組均為>60歲的患者)，漢族；③發(fā)病距就診日期在7 d內；④完成顱腦磁共振彌散加權成像成像(diffusion weighted imaging，DWI)檢查；⑤實驗方案通過我院倫理委員會批準，全部研究對象均簽署書面知情同意書。

1.1.2 排除標準 存在腦供血動脈粥樣硬化的患者出現(xiàn)心源性腦栓塞；存在嚴重心、肝、腎功能障礙的患者；風濕性疾病、慢性炎癥性疾病以及結核、惡性腫瘤、妊娠者。患者或家屬不同意參加此項研究。

1.1.3 分組 依據(jù)頸動脈B超檢查結果分為頸動脈不穩(wěn)定斑塊組、頸動脈穩(wěn)定斑塊組。頸部血管超聲檢查發(fā)現(xiàn)頸動脈狹窄，且做頸動脈內膜剝脫術的缺血性卒中患者20例。收集所有入組患者的臨床資料，具體包括性別、年齡、既往疾病、吸煙史、飲酒史、白蛋白、總蛋白、空腹血糖、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、尿酸。

1.2 頸內動脈多普勒超聲檢查 頸動脈超聲檢查由超聲診斷科從事血管超聲的兩名高年資醫(yī)師獨立操作。取其結果一致的病例入組。將所有大動脈型粥樣硬化型腦梗死患者于入院2 d內完善頸動脈多普勒超聲檢查，當一側頸動脈內膜中層厚度≥1.2 mm時提示斑塊形成，將斑塊分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊。穩(wěn)定斑塊(硬斑塊)為超聲提示斑塊強回聲伴聲影、表面光滑、質地均勻；不穩(wěn)定斑塊(軟斑塊)為超聲提示低回聲或回聲強弱不均、表面高低不平、質地不均勻等。混合型斑塊(既有穩(wěn)定斑塊又有不穩(wěn)定斑塊)歸類為不穩(wěn)定斑塊組[2，3]。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣本蛋白的提取 取樣品加入適量lysisbuffer(7 M尿素，2 M硫脲，0.1% CHAPS)，渦旋混勻，(裂解液：蛋白酶抑制劑50：1加入蛋白酶抑制劑)組織破碎儀70 Hz，60 s，重復3次。細胞樣本加入適量lysisbuffer(7 M尿素，2 M硫脲，0.1%CHAPS)，渦旋混勻，超聲1 s，停1 s，累計20 s。14000 r/min，離心30 min，取上清，分裝，留取5 μl定量，其余凍入-80 ℃。

1.4.2 蛋白定量 采用Bradford法測定提取的蛋白濃度。先將樣本用lysis buffer進行一定倍數(shù)稀釋使其終濃度落在標準曲線范圍內，稀釋好的樣本和標準品(將BSA用lysis buffer溶解成系列濃度的標準蛋白)各取10 μl分別和300 μl蛋白定量染料避光反應20 min，用酶標儀同時測定標準品和樣本在595 nm下的吸光值，根據(jù)標準品每管吸光值和濃度的關系繪制標準曲線，然后計算樣本濃度。

1.4.3 利用SDS-PAGE酶解 用手術刀將每塊膠切成1 mm3小塊兒，置于1.5 ml Eppendorf 管中；用200 μl雙蒸水洗2次，每次10 min；加考染脫色液[50 mmol/L NH4HCO3與ACN(1：1)]或銀染脫色液200 μl {K3[Fe(CN)6] 與Na2S2O3(1：1)}，脫色15 min，雙蒸水洗，重復3次，直至脫色完全；加 ACN 100 μl 脫水至膠粒變白，真空抽干10 min；加10 mmol/L DTT(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，37 ℃水浴1 h，加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白；加 55 mmol/L IAA(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，置于暗室30 min，加ACN 100 μl脫水至膠粒變白；依次用下列溶液進行混懸清洗：雙蒸水(1次)、ACN(1次)、雙蒸水(1次)、 ACN(1次)每次10 min；將0.01 μg/μl胰蛋白酶工作液(酶液用25 mmol/L NH4HCO3稀釋)，每管加100 μl，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4 ℃放置30 min。待酶液被膠粒完全吸收，再加25 mmol/L NH4HCO3100 μl，37 ℃過夜；次日離心收集酶解上清液，置于另一Eppendorf管中；剩余膠粒用抽提緩沖液(5%TFA、95% ddH2O)1 h，收集酶解上清液，置上一Eppendorf管中合并；剩余膠粒再用抽提緩沖液(2.5%TFA、50%ACN、47.5% ddH2O)1 h，收集酶解 上清液，置于上一Eppendorf管中合并；真空凍干，-20 ℃保存。

1.4.4 反相色譜OrbitrapFusion 進行蛋白質分析 將凍干樣本用60 μl 2%甲醇，0.1%甲酸復溶。12，000 r/min 離心10 min，吸取上清上樣。每次上樣體積10 μl，采取夾心法上樣，重復3次。LoadingPump流速300 nl/min，15 min。分離流速600 nl/min。

1.4.5 質譜數(shù)據(jù)處理

1.4.5.1 數(shù)據(jù)庫 數(shù)據(jù)庫的選擇是以所需物種、數(shù)據(jù)庫注釋完備性及序列可靠性為參考依據(jù)的。在選擇數(shù)據(jù)庫時，遵循如下原則，若為已經(jīng)測序生物，直接選用該物種數(shù)據(jù)庫，若為非測序生物，則選擇與被測樣品最為相關的大類蛋白質組數(shù)據(jù)庫。本次使用數(shù)據(jù)庫：Uniprot-HUMAN(20190420 Download)數(shù)據(jù)庫。

1.4.5.2 檢索軟件 Label-free的質譜分析是由Orbitrap Fusion型質譜完成，產生的質譜原始文件 采用產MaxQuant軟件處理。

b) 閥門開啟瞬間保護軟閥芯密封面。閥門開啟瞬間閥芯頭部和閥座之間的間隙小于軟閥芯和閥座之間的間隙，使得閥芯延長段和閥座之間的介質流速遠大于軟閥芯和閥座之間的介質流速，實現(xiàn)了保護閥門軟密封面的作用。

2 結 果

2.1 不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組間臨床資料比較 10例不穩(wěn)定斑塊組男性6例，女性4 例；年齡(66.5±5.5)歲。10例穩(wěn)定斑塊組男性5例，女性5 例；年齡(64.3±4.2)歲。單因素分析顯示，不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組間在性別、年齡、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、高密度脂蛋白、白蛋白、總蛋白、尿酸等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 鑒定結果的總體分析和差異蛋白篩選

2.2.1 全局分析 直接提取Maxquant搜索后的結果中各樣品的定量值，去除有0 的結果后，得到Global目錄下的proteinGroups. normalize. rm0.heatmap. txt文件，聚類分析的結果顯示不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組之間蛋白表達存在明顯差異(見圖1)。

2.2.2 差異蛋白篩選 定量值在進行中值歸一化后得到proteinGroups. normalize. keep. txt 文件的結果，進一步用perseuse歸一化后，得到proteinGroups. normalize. keep. imputation. txt的結果。由于樣品的重復次數(shù)大于等于3 次，因此直接采用t-test 進行差異分析，卡p value 0.05，F(xiàn)old change 1.2倍，得到差異蛋白的分析結果。定出差異表達蛋白1240個，在不穩(wěn)定斑塊中，表達下調的蛋白有432個，表達上調的有808個(見圖2)。

2.2.3 COG分析 COG(Clusters of Orthologous Groups)分析是基于COG 數(shù)據(jù)庫是對基因產物進行同源分類的而建立的，COG 建立了一個識別直系同源基因(指不同物種之間同源的基因，是因為物種分化而逐漸產生差異的)的數(shù)據(jù)庫，通過對多種生物的蛋白質序列大量比較而來的。COG 分析顯示差異表達蛋白涉及信號轉導、脂質轉運和代謝、翻譯后修飾、、細胞骨架、蛋白酶解等方面(見圖3)。

2.2.4 GO分析 基因本體(Gene Ontology，GO)是描述基因的功能、定位和活動的一個標準詞匯表，具有樹形結構，是分子生物學領域應用最廣的本體，已經(jīng)成為生物信息領域中一個極為重要的方法和工具(見圖4)。

圖1 全局分析聚類熱圖

圖2 差異蛋白火山圖

圖3 COG 功能分類統(tǒng)計圖

圖4 細胞組分富集度分析

3 討 論

蛋白質組(Proteome)的概念由澳大利亞學者Wilkins和Willian于 1994年提出，指由一個基因組genome或一個細胞、組織表達的所有 protein，也可以說是指細胞或組織或機體全部蛋白質的存在及其活動方式[3]。蛋白質組學旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式。蛋白質組技術的出現(xiàn)是生命科學領域的一個巨大進步。蛋白質組學被認為是后基因組研究中的最主要部分。蛋白質組學作為一門系統(tǒng)的高通量差異蛋白篩查技術，在疾病的發(fā)病機制、標志物篩選中發(fā)揮著越來越重要的作用。非標記定量蛋白質組學近年來成為重要的質譜定量方法[3，4]，按照其原理分，主要有兩種。其中spectrum counts類的非標記定量方法，發(fā)展比較早，也形成了多種算法進行定量，但是主要的原理都是根據(jù)MS2的鑒定結果作為定量的基礎，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數(shù)據(jù)上的修正。第二種非標記定量方法的原理是以MS1為基礎，計算每個肽段信號在LCMS 質譜上的積分，這個也是本研究所采用的Maxquant 算法的原理。Label free(LFQ)算法，簡單的來說，首先是對每個LCMS數(shù)據(jù)中的肽段信號進行識別并定量，然后使用內置的Andromeda算法對所有肽段信號的MS2進行數(shù)據(jù)庫檢索，完成定性工作，最后整合所有的定性定量數(shù)據(jù)，完成整個定量蛋白質組學數(shù)據(jù)工作[5]。

Donners等選擇動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定型和伴血栓斑塊型，應用二維凝膠電泳和質譜技術，結果顯示αl-抗胰蛋白酶在伴血栓斑塊表達，研究者認為αl-抗胰蛋白酶在伴血栓斑塊病變中表達上調是一種防御機制，能夠抑制膠原蛋白酶和彈性蛋白酶活性，可能提高斑塊的纖維化[6]。Part 等利用2DE 對頸動脈動脈粥樣硬化斑塊核心區(qū)和周圍正常區(qū)組織進行蛋白質組學研究。鑒定出21 種差異蛋白，其中hsp27 被驗證并認為是潛在的動脈粥樣硬化生物標記物[7]。Bagnato等利用蛋白質組學研究35個冠狀動脈斑塊樣本。樣本有石蠟、冰凍組織和多聚甲醛固定標本。從石蠟包埋組織可以鑒定225 種蛋白，從冰凍組織中卻可以鑒定出558 種蛋白。而且他們對冠狀動脈血管壁層進行了激光分割，通過LC-MS/MS 分析，共鑒定出806 種蛋白。并確認了4 種在動脈粥樣硬化疾病進展中發(fā)揮作用重要蛋白，包括：轉化生長因子β(TGF β)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生因子β(PDGF β)和基質細胞源性因子1α(SDF 1α)[8]。

本實驗采用Lable Free非標記定量蛋白質組學對頸動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊進行蛋白質組學差異比較，鑒定出差異表達蛋白1240個，在不穩(wěn)定斑塊中，表達下調的蛋白有432個，表達上調的有808個。并運用COG 分析顯示差異表達蛋白涉及信號轉導、脂質轉運和代謝、翻譯后修飾、細胞內轉運、細胞骨架、蛋白酶解等方面。通過比較Fold change 值，得出Fold change值大的差異蛋白為溶酶體膜蛋白2，?；崦窮AHD1，丙酮酸脫氫酶復合物的乙酰轉移酶組分，三激酶/FMN環(huán)化酶，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1，復制蛋白A 70 kDa DNA結合亞單位，HLAⅠ類組織相容性抗原B-81α鏈，蛋白質精氨酸N-甲基轉移酶1，二氫嘧啶酶相關蛋白3，熱休克蛋白75。

頸動脈粥樣硬化斑塊形成是一種涉及多種蛋白、細胞和組織異常的復雜疾病病理過程。雖然近年來國內外學者對動脈粥樣硬化進行了廣泛的多學科蛋白質組學研究，但還有許多問題需要做更深入的探討，如組織分離技術還是不夠精細；鑒定出動脈粥樣硬化差異蛋白敏感性和特異性不高；一些作用不明的蛋白在不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊之間存在明顯差異[9]。本研究標本量較少，對差異蛋白未在斑塊組織進行免疫組織化學驗證觀察，需要進一步研究。