腺苷預(yù)處理對(duì)缺血性腦卒中大鼠血腦屏障通透性及AQP4表達(dá)的影響

許二妮， 龐艷利， 譚 軍

腦卒中的發(fā)生率很高，缺血性腦卒中的比例很大。腦缺血后恢復(fù)血液供應(yīng)可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的腦功能障礙，這種現(xiàn)象稱(chēng)為缺血再灌注(ischemia reperfusion IR)。腦水腫是腦缺血再灌注損傷的常見(jiàn)后遺癥。腦水腫的機(jī)制尚未完全闡明，可能與腦微循環(huán)，血腦屏障疾病和水通道蛋白等因素有關(guān)。血腦屏障通常起屏障作用，并維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)部環(huán)境。血腦屏障的結(jié)構(gòu)完整性和功能取決于內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面水通道蛋白4( aquaporin-4，AQP4) 的表達(dá)及其活性形式OAPs( orthogonal arrays of particles) 的形成[1，2]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)AQP4的表達(dá)與血腦屏障通透性呈正相關(guān)。缺血性損傷后一系列病理生理變化破壞了血腦屏障的完整性，導(dǎo)致其通透性增加，致腦水腫形成。血腦屏障結(jié)構(gòu)的完整性與腦水腫的形成密切相關(guān)，因此解決受損的血腦屏障問(wèn)題已成為預(yù)防缺血再灌注損傷的關(guān)鍵[3]。使用神經(jīng)保護(hù)劑改善腦缺血再灌注損傷受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，腺苷具有大腦保護(hù)作用。腺苷對(duì)缺血再灌注損傷的血腦屏障功能影響的先前研究尚未在文獻(xiàn)中報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了腺苷預(yù)處理對(duì)缺血性卒中大鼠血腦屏障通透性和AQP4表達(dá)的影響，從血腦屏障的角度來(lái)探討腺苷對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響及其可能的腦保護(hù)機(jī)制，并為腺苷用于預(yù)防或減輕缺血性腦卒中后腦水腫的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠180只(250±30 g)，在通風(fēng)良好的動(dòng)物籠中飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(F組)、模型組(IR組)、腺苷預(yù)處理組(AP組)，每組60只。每組按術(shù)后執(zhí)行時(shí)間分為4個(gè)亞組：6 h、24 h、48 h和 72 h (F6、24、48、72 h、ir6、24、48、72 h、AP6、24、48、72 h)。腺苷注射液1.5 mg/kg(生理鹽水稀釋至2 ml)于造模前3 d腹腔注射于AP組，每日1次，連續(xù)3 d；F、IR組于術(shù)前3 d腹腔注射生理鹽水2 ml，每日1次，共3次。

1.2 主要儀器、藥品與試劑 MACO線栓(北京西濃科技有限公司)；腺苷注射液(沈陽(yáng)光大制藥有限公司)；Evans Blue粉末(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗大鼠AQP4多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 AP組和IR組制作大腦中動(dòng)脈閉塞( MCAO)模型。實(shí)驗(yàn)所需用具均75%酒精消毒。術(shù)前腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100g)麻醉，麻醉后固定在大鼠解剖專(zhuān)用手術(shù)臺(tái)上，行頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，向近端分離出頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)及頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)。無(wú)菌縫線結(jié)扎CCA和ECA后，動(dòng)脈夾夾閉ICA，在ICA和ECA交叉口下方1.0 cm處用眼科剪在CCA上剪一斜小口，將MCAO線栓插入斜小口進(jìn)入ICA，結(jié)扎CCA，松開(kāi)動(dòng)脈夾，連續(xù)插入MCAO線栓，使線栓上標(biāo)記的黑點(diǎn)進(jìn)入動(dòng)脈交叉處，即插入深度約為18～20 mm，說(shuō)明線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈，固定并結(jié)扎線栓，然后縫合皮膚、消毒。栓塞2 h后，拔出約1 cm線栓，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈和Willis環(huán)的血供。F組僅切取頸部皮膚，分離ICA、ECA、CCA，不結(jié)扎暴露，逐層縫合消毒。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠生命體征進(jìn)行嚴(yán)密觀察，術(shù)后單獨(dú)籠飼養(yǎng)。

1.4 腦水含量的測(cè)定 每個(gè)亞組隨機(jī)取5只大鼠斷頭取腦，應(yīng)用干、濕重法，將腦組織放在電子天平上，秤濕重，置入烤箱中(105 ℃，24 h)，秤干重。腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 EB滲透法定量分析血腦屏障通透性變化 缺血后2 h，再灌注各時(shí)間點(diǎn)前1 h，股靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液，劑量4 ml/kg，通過(guò)血液循環(huán)可以看到老鼠的口鼻、四肢變藍(lán)；循環(huán)2 h后，0.9%氯化鈉溶液200 ml以50 ml/min的速度經(jīng)左心房灌注，可見(jiàn)透明液體從左耳廓流出，斷頭取腦稱(chēng)重；稱(chēng)取腦組織，置于甲酰胺溶液(1 ml/100 mg)中，勻漿，60℃恒溫水浴中孵育24 h，離心(時(shí)間：20 min；轉(zhuǎn)速：4000 r/min)，提取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)630 nm處吸光值(OD值)，同時(shí)測(cè)定已知不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)EB的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的EB含量。

1.6 AQP4免疫組化檢測(cè) 烤片，脫蠟，水化，3%H2O2，室溫孵育10 min，浸入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，加熱至100 ℃抗原修復(fù)5 min，加入一抗(兔抗大鼠AQP4多克隆抗體，稀釋1∶100)，4 ℃過(guò)夜，加入生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，封片。最后光學(xué)顯微鏡觀察，采用HPIAS-2000病理圖文分析系統(tǒng)，對(duì)每張切片大腦陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度進(jìn)行平均光密度測(cè)量，就AQP4的表達(dá)分析其平均光密度值(mean optical density，MOD)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量 IR組和AP組與F組比較腦水含量均明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AP組與IR組比較，腦水含量顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)EB滲出變化 IR組和AP組EB滲出量與F組比較均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IR組和AP組組內(nèi)比較，6 h～48 h腦組織EB滲出量呈逐漸上升趨勢(shì)，48 h達(dá)到高峰后開(kāi)始下降但仍高于正常水平；AP組EB滲出量均低于IR組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的EB滲出量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)AQP4表達(dá)變化 光鏡下，AQP4陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于梗死周?chē)[區(qū)、梗死側(cè)皮質(zhì)及血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞等。AQP4陽(yáng)性為膜蛋白棕黃色或褐色的深染。AQP4蛋白在F組表達(dá)較弱，僅有少量陽(yáng)性細(xì)胞；在IR組和AP組AQP4蛋白表達(dá)明顯高于F組，AQP4蛋白表達(dá)在缺氧缺血后隨時(shí)間延遲表達(dá)逐漸增多；與IR組比較，AP組AQP4蛋白表達(dá)逐漸下降(見(jiàn)圖1)。

2.4 大鼠腦缺血再灌注損傷后EB滲出量與AQP4之間的相關(guān)性分析 經(jīng)SPSS22.0軟件檢驗(yàn)，腦缺血再灌注損傷造模組(IR組和AP組)各時(shí)間點(diǎn)EB含量和AQP4均符合正態(tài)分布，用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。腦缺血再灌注損傷后AQP4的表達(dá)與EB含量(r=0.898)呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腦缺血再灌注損傷后AQP4表達(dá)越高，血腦屏障通透性越高(見(jiàn)圖2)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量的比較

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)EB滲出量的比較

表3 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)AQP4表達(dá)變化平均光密度值)

F組×400倍 IR-6 h組×400倍 IR-24 h組×400倍

IR-48 h組×400倍 IR-72 h組×400倍 AP-6 h組×400倍

AP-24 h組×400倍 AP-48 h組×400倍 AP-72 h組×400倍

圖2 AQP4表達(dá)與EB滲出量的相關(guān)性

由圖1和表3可見(jiàn)：IR組和AP組AQP4表達(dá)與F組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IR組和AP組組內(nèi)比較，6 h～48 h AQP4表達(dá)逐漸升高，于48 h達(dá)高峰，再灌注72 h時(shí)仍處于高峰；AP組AQP4表達(dá)明顯低于IR組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

缺血性卒中的治療是盡快恢復(fù)腦血流灌注，但是腦血流灌注恢復(fù)后不可避免地會(huì)導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷，這是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過(guò)程。預(yù)防比治療更重要，并且現(xiàn)在越來(lái)越關(guān)注預(yù)處理方法。腦缺血預(yù)處理的更多選擇是藥物預(yù)處理。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將許多外源性藥物用于腦缺血再灌注時(shí)，可通過(guò)不同途徑刺激內(nèi)源性腺苷的分泌，從而保護(hù)腦組織[5]。考慮到外源性腺苷也可用于治療缺血再灌注腦損傷，本實(shí)驗(yàn)使用外源性腺苷探索其在缺血性卒中中的作用及其可能的相關(guān)機(jī)制。譚軍等[6～8]該研究小組的論文在研究中得出了某些結(jié)論，為實(shí)驗(yàn)成功提供了基礎(chǔ)。

血腦屏障是指腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障。血液中多種溶質(zhì)從腦毛細(xì)血管進(jìn)入腦組織，有難有易，有些很快，有些較慢通過(guò)，有些則完全不能通過(guò)，這種有選擇性的通透現(xiàn)象稱(chēng)為血腦屏障通透性。在生理?xiàng)l件下，血腦屏障嚴(yán)格控制電解質(zhì)等水溶性物質(zhì)進(jìn)入腦組織，主要起屏障作用。腦水腫是腦缺血再灌注損傷的主要并發(fā)癥之一。血管源性腦水腫主要是由于血腦屏障完整性受到破壞，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加引起血漿蛋白、水分和電解質(zhì)等大分子物質(zhì)向外滲出所致的細(xì)胞間質(zhì)水腫。血腦屏障是血液與腦組織之間的屏障，在生理?xiàng)l件下，血腦屏障嚴(yán)格控制電解質(zhì)等水溶性物質(zhì)進(jìn)入腦組織，主要起屏障作用。腦缺血再灌注后的一系列病理生理變化損害了血腦屏障的完整性，增加了血腦屏障的通透性，促進(jìn)了腦水腫的形成[9，10]。實(shí)驗(yàn)測(cè)定腦組織含水量即可以反應(yīng)血腦屏障通透性的變化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺苷預(yù)處理后腦組織含水量較模型組明顯減少。這表明腺苷預(yù)處理可減輕腦水含量從而達(dá)到保護(hù)腦組織的作用。正常情況下血漿白蛋白無(wú)法透過(guò)血腦屏障，EB是一種常用的偶氮染料制劑，與血漿蛋白高度親和，因此EB在神經(jīng)科學(xué)研究中常被用于示蹤劑觀察血腦屏障的完整性[11]。染色時(shí)，如果血腦屏障是完整的，血漿白蛋白無(wú)法透過(guò)血腦屏障，與血漿白蛋白結(jié)合的EB無(wú)法使其著色；相反如果血腦屏障被破壞，血漿白蛋白透過(guò)血腦屏障，與EB結(jié)合使其著色。本實(shí)驗(yàn)中，選用EB作為血腦屏障的示蹤劑，它可以與血清蛋白結(jié)合形成伊文思藍(lán)結(jié)合蛋白，僅當(dāng)打開(kāi)血腦屏障時(shí)伊文思藍(lán)結(jié)合蛋白才能隨血管內(nèi)的蛋白成分進(jìn)入組織間隙，滲出到腦組織中的EB的量與血腦屏障破壞的程度呈正相關(guān)[12]。運(yùn)用其來(lái)測(cè)定缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的血腦屏障通透性。結(jié)果顯示，缺血再灌注6 h，模型組和腺苷預(yù)處理組的EB滲出量與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明血漿蛋白滲出，血腦屏障已打開(kāi)，通透性增加，并且呈上升趨勢(shì)。它在48 h達(dá)到峰值，在72 h下降，但仍高于正常水平。這表明血腦屏障通透性與再灌注時(shí)間密切相關(guān)。這與王社軍等[13]的發(fā)現(xiàn)是一致的，其通過(guò)測(cè)量腦組織中14C蔗糖的方法對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注后通透性的研究。與模型組相比，腺苷預(yù)處理組的EB滲出量明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明腺苷可以抑制缺血再灌注后血腦屏障通透性的增加，從而減輕血管源性腦水腫，減輕腦損傷。

據(jù)報(bào)道，腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成與水通道(aquaporin，AQP)密切相關(guān)[14]。其中，AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道，廣泛分布于腦組織，與腦水腫形成的生理病理過(guò)程密切相關(guān)。AQP4在腦毛細(xì)血管星形膠質(zhì)細(xì)胞足突和腦室室周上皮細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外空間維持腦細(xì)胞的滲透穩(wěn)態(tài)，維持大腦的興奮性，具有重要的生理功能[15]。有研究指出[16]，AQP4的表達(dá)水平變化與腦水腫的發(fā)生發(fā)展及消退基本一致。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，兩側(cè)靜水壓和滲透壓的不平衡是導(dǎo)致血腦屏障滲透率增加的主要原因。隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)AQP4也參與調(diào)控血腦屏障的發(fā)育成熟，其表達(dá)水平與血腦屏障的完整性密切相關(guān)[17～19]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后6 h～48 h模型組及腺苷預(yù)處理組AQP4表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，48 h達(dá)高峰，72 h仍處于較高水平。此過(guò)程與腦組織EB滲出量變化趨勢(shì)一致。這符合Mardey[20]的研究模型即腦水腫所致急性水中毒，AQP4低表達(dá)在正常腦組織和高表達(dá)在腦水腫，表明AQP4與腦水腫密切相關(guān)。與Taniguchi等[21]對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞后腦水腫的研究結(jié)果相似，AQP4 mRNA表達(dá)上調(diào)與腦組織含水量的結(jié)果平行。說(shuō)明AQP4是膠質(zhì)細(xì)胞、血液和腦脊液之間水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸水分的重要通道，其表達(dá)水平與血腦屏障的完整性密切相關(guān)。也證實(shí)AQP4的表達(dá)與缺血再灌注后血腦屏障通透性損傷密切相關(guān)。由此可見(jiàn)，AQP4與腦水腫的形成密切相關(guān)，同時(shí)提示AQP4可能通過(guò)影響血腦屏障而參與水腫的形成。結(jié)果還顯示腺苷預(yù)處理組AQP4表達(dá)低于模型組，說(shuō)明腺苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過(guò)某種通路途徑抑制AQP4的表達(dá)，減輕血腦屏障的損傷，從而減輕腦水腫，達(dá)到治療缺血性腦血管病的目的。

綜上所述，腺苷預(yù)處理可能通過(guò)下調(diào)AQP4表達(dá)，改善血腦屏障通透性，減輕腦水腫，起到腦保護(hù)的作用，為腺苷預(yù)處理用于缺血性腦卒中的臨床治療提供了理論依據(jù)，但對(duì)于腺苷預(yù)處理下調(diào)AQP4表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，其有待進(jìn)一步研究。