腫瘤異常蛋白與Ki-67抗原在新診斷膠質(zhì)瘤患者中的表達及相關(guān)性分析

張國臣，韓磊，康建磊，徐欣，趙明#，陳忠平

1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450008

2中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科/神經(jīng)腫瘤科，廣州 510060

腫瘤異常蛋白（tumor abnormal protein，TAP）是細胞中致癌因子誘發(fā)原癌基因和抑癌基因突變后產(chǎn)生的一種腫瘤標(biāo)志物，對腫瘤類別不具有特異性，能夠廣譜、早期監(jiān)測患者血液中腫瘤細胞的存在[1]；Ki-67抗原是目前判斷腫瘤惡性程度和腫瘤細胞增殖活性的最常用指標(biāo)[2]。本研究回顧性分析51例新診斷膠質(zhì)瘤患者的病歷資料，旨在探討二者在新診斷膠質(zhì)瘤患者中的表達及相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2019年3月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科收治的新診斷膠質(zhì)瘤患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理證實為膠質(zhì)瘤；②既往未行手術(shù)、放化療等任何治療措施的新診斷膠質(zhì)瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他全身系統(tǒng)疾病，不能耐受手術(shù)，無法經(jīng)病理證實；②手術(shù)前經(jīng)試驗性放療、化療、抗腫瘤治療等；③復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入新診斷膠質(zhì)瘤患者51例，其中男28例，女23例；年齡6～84歲，平均（53.24±15.38）歲；腫瘤位置：額葉20例，顳葉11例，頂葉3例，枕葉1例，島葉3例，丘腦1例，小腦6例，侵犯兩個腦葉及以上6例；病理類型：星形細胞瘤21例[世界衛(wèi)生組織（WHO）Ⅱ級9例，WHOⅢ級12例]，少突膠質(zhì)細胞瘤9例（WHOⅡ級6例，WHOⅢ級3例），少突星形細胞瘤1例（WHOⅡ級），室管膜瘤2例（WHOⅡ級），膠質(zhì)肉瘤2例（WHOⅣ級），膠質(zhì)母細胞瘤16例（WHOⅣ級）。

1.2 檢測儀器與試劑

TAP檢測系統(tǒng)圖像分析儀和TAP凝聚助劑試劑盒均購自浙江瑞生醫(yī)療科技有限公司；Ki-67抗體試劑及配套試劑均購自美國Ventana Medical Systems.Inc.。BenchMark XT全自動多功能組織病理檢測系統(tǒng)購自美國羅氏企業(yè)有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 TAP檢測方法 清晨采集入組患者空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血1 ml，取適量靜脈血制作2張均勻血涂片，晾干待用；將TAP凝聚助劑搖勻，置恒溫恒濕工作環(huán)境（溫度18～25℃，相對濕度45%～60%）平衡30 min，同時將血涂片置相同環(huán)境10 min，取試劑上層液在每張血涂片上均勻滴加3滴（每滴約50 μl），形成3個斑點，平放靜置晾干約2 h；在TAP檢測系統(tǒng)圖像分析儀的顯微鏡下依次觀察2張血涂片上的共6個斑點，尋找特異形態(tài)的凝聚物（不規(guī)則類圓形類晶體顆粒，顆粒呈淡綠色、淡黃色或棕色，中心有屈光性，四周因混合物較多而呈棕黑色或墨綠色）。

1.3.2 Ki-67抗原檢測方法 取常規(guī)石蠟包埋組織切片并制成與檢測儀器相對應(yīng)的載玻片，將Ki-67抗體試劑和所需的配套試劑放到試劑托盤上，再將托盤和載玻片放到儀器相應(yīng)位置，啟動儀器進行自動染色，待染色完成后，將載玻片取下，用酒精進行脫水、清洗，二甲苯透明，以中性樹膠和蓋玻片封片。在光學(xué)顯微鏡高倍視野下尋找細胞核有棕黃色著色的特定細胞。

1.4 判定方法及標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 TAP 對觀察到的特異形態(tài)凝聚物的面積大小進行測定，單顆凝聚物面積≥81 μm2為有效凝聚物，以所有凝聚物面積大小的平均值作為最終測定結(jié)果。若無有效凝聚物或81 μm2≤凝聚物面積＜121 μm2，判定為TAP正常/無明顯凝聚物；若121 μm2≤凝聚物面積＜225 μm2，判定為 TAP異常（陽性）/凝聚物較??；若凝聚物面積≥225 μm2，判定為TAP異常（陽性）/凝聚物較大。

1.4.2 Ki-67抗原 隨機選取5個高倍視野分別計算陽性細胞占全部細胞的百分比，以5個視野的平均值作為最終測定結(jié)果。陽性結(jié)果分為1～3級，分別為：陽性細胞＜10%，10%≤陽性細胞≤40%，陽性細胞＞40%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAP與Ki-67抗原的表達情況及相關(guān)性

TAP在新診斷膠質(zhì)瘤中的陽性表達率為100%（51/51），Ki-67抗原在新診斷膠質(zhì)瘤中的陽性表達率為（30.29±18.80）%。TAP與Ki-67抗原表達情況呈正相關(guān)（r=0.338，P=0.014），TAP與年齡（r=0.181，P=0.199）、Ki-67抗原與年齡（r=0.132，P=0.351）均無相關(guān)性。

2.2 膠質(zhì)瘤級別與TAP、Ki-67抗原的關(guān)系

高級別及低級別膠質(zhì)瘤中，TAP與Ki-67抗原表達情況均呈正相關(guān)（r=0.398、0.470，P=0.020、0.041）。高級別膠質(zhì)瘤中TAP、Ki-67抗原的表達均明顯高于低級別膠質(zhì)瘤，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 高級別及低級別膠質(zhì)瘤中TAP、Ki-67抗原表達量的比較（±s）

表1 高級別及低級別膠質(zhì)瘤中TAP、Ki-67抗原表達量的比較（±s）

級別TAP（μm2）Ki-67抗原（%）

3 討論

TAP也稱異常糖鏈糖蛋白，是細胞中原癌基因和抑癌基因在致癌因子作用下發(fā)生突變的過程中從細胞膜表面脫落到血液中的惡變產(chǎn)物，是腫瘤細胞異常增殖過程中的重要變異指標(biāo)，TAP不屬于特異性腫瘤標(biāo)志物，可結(jié)合其他臨床檢測手段應(yīng)用于多種腫瘤的輔助診斷[3-7]。TAP檢測技術(shù)是針對該惡變產(chǎn)物的一種異常糖鏈多級偶聯(lián)技術(shù)，可以使20余種與腫瘤密切相關(guān)的糖鏈結(jié)構(gòu)異常的糖蛋白相互凝聚，從而被TAP檢測儀器識別分析，該技術(shù)是由烏克蘭醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究發(fā)明的，于1997年引入中國，并逐漸應(yīng)用于癌癥的早期診斷的篩查過程，在阻斷癌癥亞臨床期向臨床期轉(zhuǎn)變過程中有重要的臨床參考意義。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，TAP檢測既可以與其他腫瘤標(biāo)志物檢測技術(shù)相互補充，防治亞臨床期癌癥的漏診、誤診[8]，同時又可以監(jiān)測臨床期癌癥在綜合治療過程中的效果以及有無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等[9-11]，臨床應(yīng)用廣泛。

Ki-67抗原是一種與細胞增殖密切相關(guān)的核抗原，是位于細胞核內(nèi)的一種非組蛋白，在細胞有絲分裂過程中起重要作用，除了細胞分裂周期的G0期無表達外，在G1期、S期、G2期、M期均有表達，M期最高，雖然其確切機制尚不完全清楚[12]，但是目前普遍認為其數(shù)值越高，處于增殖周期的細胞總數(shù)越多，細胞倍增速度越快。Ki-67抗原臨床應(yīng)用范圍廣泛，尤其是在腫瘤組織的檢測中更是必查項目之一，常用來判斷腫瘤的性質(zhì)及惡性程度，預(yù)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。對于良性腫瘤，細胞有絲分裂過程緩慢、細胞周期長，檢測到的Ki-67數(shù)值常較低，而在惡性腫瘤中，因腫瘤細胞侵襲性強，有絲分裂迅速，細胞周期短，Ki-67數(shù)值常較高，因此，Ki-67陽性率能準(zhǔn)確地反映腫瘤細胞的增殖活性，判斷腫瘤的惡性程度，指導(dǎo)腫瘤的輔助治療。

膠質(zhì)瘤是一種原發(fā)于顱內(nèi)的惡性腫瘤，只有惡性程度高低之分，沒有腫瘤分期，Ki-67抗原是判斷膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一。由于血腦屏障的存在，膠質(zhì)瘤的早期診斷、治療不同于其他部位的惡性腫瘤，且監(jiān)測技術(shù)也有差別。膠質(zhì)瘤的早期診斷主要依靠影像學(xué)檢查，TAP在膠質(zhì)瘤的早期診斷中尚無文獻報道表現(xiàn)出特別的價值，但是其與膠質(zhì)瘤的惡性程度是否有關(guān)尚未確定。為防止放化療、抗腫瘤等綜合治療影響結(jié)果，本研究排除經(jīng)過放化療、抗腫瘤治療的新診斷膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，TAP在新診斷膠質(zhì)瘤中的陽性表達率可達100%，且不受年齡影響，其與Ki-67抗原之間存在相關(guān)性，即TAP的大小可以間接反映Ki-67抗原的活性，而Ki-67抗原的活性與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此，動態(tài)監(jiān)測TAP可輔助早期發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等進展情況；另外本組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TAP與Ki-67抗原的相關(guān)性不受膠質(zhì)瘤級別的影響，且高級別膠質(zhì)瘤TAP和Ki-67抗原表達均明顯高于低級別膠質(zhì)瘤，亦符合膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。當(dāng)然，本研究仍有不足之處，尚未收集膠質(zhì)瘤綜合治療過程中TAP的變化情況及其與膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，需在以后的工作中加以隨訪、統(tǒng)計進一步討論TAP在膠質(zhì)瘤患者中的臨床意義。

綜上所述，TAP雖然不具有特異性，但是其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在較大價值，TAP與Ki-67抗原表達情況在膠質(zhì)瘤患者中有一定相關(guān)性，因此，在膠質(zhì)瘤綜合治療過程中，定期、動態(tài)檢測TAP，能夠間接反映Ki-67抗原的水平，從而間接反映膠質(zhì)瘤的治療效果，有一定的臨床參考意義。