B7-H3在結(jié)直腸癌中的研究進展

金玉芬，張婷，姜新，章立華，茆勇#

1江南大學無錫醫(yī)學院腫瘤免疫與耐藥實驗室，江蘇 無錫 277100

2江南大學附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 無錫 277100

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的惡性腫瘤，也是導致惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因，對患者的生活質(zhì)量和生命健康造成嚴重影響[1-2]。美國的一項調(diào)查結(jié)果顯示，CRC是一種典型的老年疾病，但是，自20世紀90年代中期以來，55歲以下CRC患者的病死率每年增長約2%[3]。雖然，近年來，對CRC生物學的理解以及治療策略的改進方面有了實質(zhì)性的進展，但由于早期CRC缺乏典型臨床癥狀，大多數(shù)患者被診斷時已處于晚期，因此，尋找新的分子標志物并完善已有的治療手段是必要的[4-5]。CRC的發(fā)生呈現(xiàn)出從正常組織經(jīng)過息肉、腺瘤、高級別瘤變等病變緩慢發(fā)展至惡性腫瘤的漫長過程，免疫細胞的浸潤、免疫因子的產(chǎn)生及其與腫瘤細胞的相互作用在微環(huán)境中發(fā)揮了極其重要的作用[6-7]。已有研究證明，B7是一類主要表達于細胞質(zhì)膜的免疫檢查點蛋白，可與T細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞的受體分子相互作用，介導免疫的共刺激或共抑制信號[7-8]。共刺激分子B7-H3是B7-CD28家族的免疫檢查點分子之一。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3在正常組織和細胞中不表達或呈極低表達，但在多種惡性腫瘤組織中異常表達，并與患者的預后密切相關(guān)[9]。隨著研究的深入，越來越多的研究顯示B7-H3參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、代謝、血管新生、抗凋亡等非免疫過程[10-13]。因此，B7-H3可能是CRC的潛在標志物和治療靶點。本文就B7-H3的結(jié)構(gòu)、功能及其在CRC中的表達情況及臨床意義的研究進展進行綜述。

1 B7-H3的結(jié)構(gòu)、分布和受體

B7-H3是在人類樹突狀細胞的互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文庫中被發(fā)現(xiàn)的B7家族的新成員，其在氨基酸序列上與B7家族其他成員的胞外域受體結(jié)合區(qū)有20%～27%的同源性，且結(jié)構(gòu)相似，因此，被命名為B7 Homolog 3（B7-H3）[14]。成熟的B7-H3分子是一個編碼316個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，包含N端的一個信號肽、一個存在細胞外的免疫球蛋白樣可變區(qū)（immunoglobulin V，IgV）和免疫球蛋白樣恒定區(qū)（immunoglobulin C，IgC）、一個跨膜區(qū)和一個含有45個氨基酸的胞內(nèi)區(qū)[15]。特別的是，人體中的B7-H3主要存在2種形式的剪切體：胞外區(qū)由IgV-IgC 組成的 B7-H3a（2Ig-B7-H3）和胞外區(qū)由IgV-IgC-IgV-IgC組成的B7-H3b（4Ig-B7-H3）。小鼠的B7-H3分子僅有2Ig-B7-H3結(jié)構(gòu)域，而人類以4Ig-B7-H3亞型表達為主[16]。此外，人體中的B7-H3除了表達于細胞膜上，還以可溶性形式存在。可溶性B7-H3分子主要存在于正常人的外周血中，可能參與多種生物學功能的發(fā)揮，但具體的調(diào)控機制及臨床意義尚有待探討[17]。

B7-H3mRNA廣泛表達于人類的免疫及非免疫組織器官，包括脾、胸腺、心臟、肝、前列腺、胎盤、睪丸、胰腺、小腸和大腸等；另外，B7-H3mRNA在正常組織和細胞中的表達水平較低，但在多種腫瘤組織和腫瘤細胞株中的表達水平較高。相較于B7-H3mRNA的廣泛表達，B7-H3在蛋白水平僅表達于少數(shù)正常組織，如人體的前列腺、乳房、肝、肺、膀胱、胎盤等；其在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達差異可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，但具體的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制目前仍不明確[18-19]，推測機體內(nèi)可能存在某種機制抑制了B7-H3在機體正常組織中的表達，而B7-H3的異常表達可能是腫瘤免疫的機制之一。

目前，由于B7-H3的受體及下游信號傳導通路尚未明確，因此，其在T細胞介導的免疫應答中的作用機制一直存在爭議。King等[20]認為TLT-2是B7-H3的受體，是髓細胞表達的觸發(fā)受體家族成員之一，其蛋白表達于CD8+T細胞，且可以被活化的CD4+T細胞所誘導。Hashiguchi等[21]通過生物信息學的方法發(fā)現(xiàn)TLT-2與CD28家族的基因序列有較高的同源性，后經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，鼠類B7-H3可與CD8+T細胞的TLT-2結(jié)合，促進T細胞的增殖、細胞因子的生成及細胞毒作用的發(fā)揮。然而，此結(jié)論隨后被Leitner等[22]否定，其采用流式細胞分析技術(shù)詳細分析了人B7-H3與TLT-2之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)兩者未存在特異性結(jié)合的現(xiàn)象，因此，認為TLT-2并非B7-H3分子相對應的受體。

2 B7-H3在CRC 中的免疫調(diào)節(jié)功能

T淋巴細胞介導的免疫應答反應在機體感染和腫瘤免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，根據(jù)功能的不同，共刺激分子主要分為兩類：正性共刺激信號，可維持T細胞的活化狀態(tài)，增強T細胞免疫應答反應；負性共抑制信號，可介導T細胞免疫耐受的形成，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮作用[23]。早期研究認為，B7-H3共同刺激CD4+T和CD8+T細胞群的增殖，增強細胞毒性T細胞的誘導，并且選擇性地刺激γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的產(chǎn)生[14]。Loos等[24]收集了68例胰腺癌患者的石蠟組織標本和臨床資料，發(fā)現(xiàn)B7-H3的表達與腫瘤浸潤CD8+T細胞有關(guān)，且存在B7-H3mRNA表達的患者的術(shù)后生存期更長。Lupu等[25]建立了結(jié)腸癌小鼠模型，結(jié)果顯示，與不表達B7-H3的對照組相比，高表達B7-H3的小鼠的腫瘤體積縮小，IFN-γ、白細胞介素（interleukin，IL）-12水平均明顯升高。

隨著研究的深入，學者們有了不同的發(fā)現(xiàn)。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)在移植肺癌模型中，腫瘤細胞中B7-H3的表達量隨著腫瘤轉(zhuǎn)化時間的延長而增加；另外，腫瘤相關(guān)巨噬細胞釋放的IL-10可以刺激腫瘤細胞膜上B7-H3的表達，抑制T細胞的免疫反應。同樣，Prasad等[27]發(fā)現(xiàn)小鼠B7-H3蛋白抑制T細胞活化和細胞因子的產(chǎn)生。此外，Ling等[28]證實B7-H3能夠抑制T細胞的體外增殖。Sun等[29]也證實B7-H3在胃癌中的高表達可以抑制機體對腫瘤的免疫監(jiān)視功能。更有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3在非小細胞肺癌中的表達水平與CD133水平呈負相關(guān)[30]。研究顯示，B7-H3的表達與CRC組織中巨噬細胞的浸潤密度呈正相關(guān)，并與患者的總生存率呈負相關(guān)，提示了B7-H3信號對巨噬細胞的直接作用；進一步研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）分化過程中，B7-H3促進了M2型巨噬細胞的極化，使M1表型向M2表型轉(zhuǎn)變。因此，通過B7-H3途徑靶向調(diào)控TAM可能對開發(fā)針對人類CRC的新型免疫治療策略具有重要價值[31]。上述結(jié)果提示高表達的B7-H3能夠負性調(diào)節(jié)腫瘤免疫應答。

3 B7-H3在CRC 中的非免疫學功能

3.1 高表達的B7-H3促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要的生物學特征，二者既有聯(lián)系，又有區(qū)別。腫瘤侵襲是指腫瘤細胞脫離原發(fā)部位，侵襲穿越基底膜并向周圍間質(zhì)浸潤性生長，是腫瘤細胞、周圍間質(zhì)相互作用的結(jié)果，也是腫瘤擴散的第一步。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位（原發(fā)腫瘤）穿越局部毛細血管或淋巴管進入血管或體腔，隨著血液運輸至靶組織或靶器官，在繼發(fā)部位不斷生長、增殖，形成與原發(fā)腫瘤不連續(xù)而組織學類型相同的腫瘤（繼發(fā)腫瘤）。腫瘤侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ)，而惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移往往是腫瘤治療失敗的主要原因[32-33]。因此，了解惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制對遏制腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要。

B7-H3可以影響腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，B7-H3過表達后通過調(diào)控人膀胱癌磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[34]。Kang等[35]發(fā)現(xiàn)B7-H3可以誘導上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），并且通過Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/STAT3信號通路調(diào)控腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。另一項研究表明B7-H3可以靶向侵襲、轉(zhuǎn)移CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4），并通過磷酸化JAK2、STAT3、AKT、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路促進胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。Liu等[36]發(fā)現(xiàn)B7-H3的過表達提高了CRC中基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達水平；另外，JAK2/STAT3通路在CRC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，抑制JAK2/STAT3信號通路可誘導CRC細胞的凋亡、阻滯，減少CRC細胞的侵襲；B7-H3通過激活JAK2/STAT3信號通路導致MMP9的表達上調(diào)，促進了CRC細胞的增殖和侵襲；此外，利用JAK2的特異性抑制劑AG490抑制JAK2/STAT3信號通路可明顯下調(diào)MMP9的表達。這些結(jié)果表明，MMP9是B7-H3/JAK2/STAT3信號通路的下游靶點，B7-H3可能通過JAK2/STAT3/MMP9信號通路促進CRC的侵襲。此外，Jiang等[37]發(fā)現(xiàn)B7-H3與CRC組織中MMP2、MMP9的表達呈正相關(guān)；體外實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，在SW480細胞中過表達的B7-H3更容易使腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，而B7-H3在Caco-2細胞中被敲除后，腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降，并且在過表達B7-H3的SW480-B7-H3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中，B7-H3可以下調(diào)E-cadherin和上調(diào)N-cadherin、CD133、CD44、Oct4的表達，提示共刺激分子B7-H3能夠促進CRC的EMT。

3.2 高表達的B7-H3促進腫瘤血管生成

血管生成參與多種生理、病理進程，如胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎性反應等，也是腫瘤的生物學特性之一[38-39]，新生血管的生長和成熟是一個復雜的過程，由多種促血管生長因子和血管生成抑制因子調(diào)節(jié)，其中，功能最強、特異性最高的是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），其能夠促進內(nèi)皮細胞的分裂、增殖及腫瘤新生血管的構(gòu)建、遷移，增加血管通透性[40]。然而，B7-H3在調(diào)節(jié)CRC血管生成中的生物學功能卻甚少。

研究表明，B7-H3在腫瘤細胞和腫瘤血管中廣泛過表達[41]。Zang等[42]發(fā)現(xiàn)B7-H3表達于卵巢癌血管內(nèi)皮細胞中，與卵巢癌的組織學分型、臨床分期、疾病復發(fā)及預后密切相關(guān)。另一項研究表明，B7-H3與VEGF在CRC血管內(nèi)皮細胞中的表達呈正相關(guān)，在CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中，共同參與腫瘤血管新生和抗腫瘤免疫反應[43]。有研究收集了125例CRC組織樣本及其鄰近正常組織標本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B7-H3在CRC組織中的水平明顯升高，并與血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又稱CD31）水平呈正相關(guān)；經(jīng)過一系列體外實驗和體內(nèi)試驗，發(fā)現(xiàn)B7-H3通過上調(diào)VEGFA的表達促進腫瘤血管生成，shB7-H3 CRC細胞的條件培養(yǎng)基明顯抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移、侵襲和成管，而過表達B7-H3的CRC細胞的條件培養(yǎng)基明顯促進了人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移、侵襲和成管。此外，重組VEGFA消除了shB7-H3 CRC細胞的條件培養(yǎng)基對HUVEC血管生成的抑制作用，而VEGFA-小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）則逆轉(zhuǎn)了B7-H3過表達CRC細胞的條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成的影響[11]。因此，B7-H3對腫瘤血管生成的作用為闡明CRC的發(fā)病機制、尋找治療靶點提供了新思路。

3.3 高表達的B7-H3促進腫瘤代謝

葡萄糖可以通過氧化磷酸化和糖酵解兩種代謝途徑為細胞提供能量，即使在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細胞也會將葡萄糖代謝為乳酸鹽，被稱為Warburg效應[39]，其代表著腫瘤細胞對葡萄糖利用方式由氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變，這種代謝變化目前被認為是腫瘤的一大生物學特征。

Lim等[44]探索了B7-H3在腫瘤細胞代謝重編程中的作用，發(fā)現(xiàn)兩個細胞株在進行B7-H3基因敲除后，乳酸產(chǎn)量和葡萄糖的攝取均明顯降低，而B7-H3高表達可以正向調(diào)控低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1），從而促進腫瘤的糖代謝。同樣，Nunes-Xavier等[45]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中B7-H3的高表達會提高細胞的存活率，促進糖酵解。異檸檬酸脫氫酶 1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）是TCA循環(huán)中的一種代謝酶，其反應產(chǎn)物參與脂質(zhì)合成。Wu等[46]采用免疫化學方法分析了225例CRC患者標本中IDH1和B7-H3的表達水平，結(jié)果顯示，IDH1與B7-H3的表達密切相關(guān)；在細胞實驗中，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測結(jié)果顯示，在高表達B7-H3的SW480-B7-H3-EGFP細胞中，IDH1的表達水平升高；同樣，在Caco-2-shB7-H3中B7-H3表達的下調(diào)亦有助于降低IDH1水平，進一步證明B7-H3和IDH1存在相關(guān)性，最終提示B7-H3可以通過影響IDH1的表達來影響腫瘤的代謝功能，但具體的調(diào)控機制仍不明確。有研究建立了兩個穩(wěn)定過表達B7-H3的CRC細胞株，與對照細胞相比，B7-H3過表達的HCT116和RKO細胞的葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量均明顯增加，己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）蛋白的表達水平也均升高，而當HK2被siRNA下調(diào)時，B7-H3誘導的葡萄糖攝取增加和乳酸產(chǎn)生能力明顯減弱；該研究還發(fā)現(xiàn)B7-H3低表達降低了STAT3的活性，并明顯下調(diào)了HK2的表達。提示B7-H3可以通過STAT3信號通路調(diào)控CRC細胞中HK2的表達[47]。

3.4 高表達的B7-H3增強耐藥性和抗凋亡能力

近年來，盡管新治療方法的出現(xiàn)使CRC的治療取得了顯著進展，但CRC患者發(fā)生耐藥成為了臨床治療的重要障礙之一。

有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，并與化療藥物的耐藥有關(guān)[48]。Shi等[47]在小鼠模型中證明了B7-H3/HK2通路能夠在體內(nèi)誘導CRC患者發(fā)生耐藥。Zhang等[49]使用不同濃度藥物孵育CRC細胞系48小時，結(jié)果顯示，過表達B7-H3的細胞對奧沙利鉑的抗性指數(shù)比對照組高4倍左右。另一項研究表明，B7-H3與抗凋亡蛋白在CRC細胞系中的表達呈正相關(guān)，提示過表達B7-H3可能增加腫瘤細胞對凋亡的抵抗。為了研究化療引起的細胞凋亡的確切反應，有研究使用高濃度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）（50 μg/ml）孵育了SW620-NC、SW620-B7-H3-EGFP細胞48小時，結(jié)果顯示，與SW620-NC相比，SW620-B7-H3-EGFP對5-FU的抗性更強，凋亡更少，提示B7-H3過表達通過減弱CRC細胞對藥物的敏感性抑制細胞的凋亡能力[50]。一項研究采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)B7-H3和CDC25A具有明顯的相關(guān)性，且認為B7-H3可以通過STAT3信號通路促進CDC25A的表達，進而增強CRC細胞的耐藥性[51]。

4 小結(jié)與展望

CRC是一種常見的惡性腫瘤。近年來，隨著治療方法的發(fā)展，CRC患者的5年生存率顯著提高。然而，疾病的轉(zhuǎn)移和復發(fā)仍然是CRC臨床治療的難點。因此，了解CRC的分子發(fā)病機制、尋找治療CRC的新靶點成為迫切需要。共刺激分子B7-H3是B7-CD28家族的免疫檢查點分子，在CRC等多種實體腫瘤中過表達。早期研究驗證了B7-H3在腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能方面的潛力，但由于B7-H3在T細胞上的受體尚未明確，因此，B7-H3的免疫功能尚存在爭議。本實驗室采用免疫組織化學技術(shù)檢測了樣本中B7-H3的表達，發(fā)現(xiàn)B7-H3在CRC組織中過表達，并與腫瘤浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移和分化程度顯著相關(guān)。值得注意的是，B7-H3高表達患者的OS明顯短于低表達患者[4]，提示B7-H3可能是一個有價值的預后生物標志物，也是一種有前途的實體瘤治療新靶點。因此，在未來還需要進一步探索與B7-H3相關(guān)的腫瘤信號通路，在臨床實驗中納入更多的樣本以確定B7-H3在CRC中的表達情況及預后意義。