細(xì)胞角蛋白19、Ki-67在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義

周冠磊，焦志波，張風(fēng)華

河北省人民醫(yī)院腺體外科，石家莊050051

甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）是指腫瘤最大直徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。隨著超聲技術(shù)及細(xì)針穿刺活檢技術(shù)的應(yīng)用及普及，PTMC的檢出率逐年增高。雖然大多數(shù)PTMC具有惰性特征，預(yù)后較好，但一些具有侵襲性的PTMC患者的預(yù)后仍然較差[2-3]。細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、Ki-67的表達(dá)與胃腸道癌、乳腺癌及前列腺癌的分化程度及預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。而關(guān)于CK19、Ki-67在PTMC中的作用仍不清楚。本研究探討PTMC中CK19、Ki-67的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系，以為PTMC患者的個(gè)體化治療及預(yù)后評估提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2018年6月河北省人民醫(yī)院收治的PTMC患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次進(jìn)行甲狀腺手術(shù)；②術(shù)后石蠟病理結(jié)果為PT-MC；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型的甲狀腺癌；②長期使用免疫抑制劑。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入PTMC患者116例。收集PTMC患者的PTMC組織，記錄患者的臨床特征，包括性別、年齡、癌灶大小、病灶數(shù)目、包膜侵犯、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等指標(biāo)。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要儀器及試劑 CK19、Ki-67抗體檢測試劑均購自BBI生命科學(xué)有限公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，醫(yī)用微波爐購自格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測PTMC組織中CK19、Ki-67蛋白表達(dá)情況，具體方法：①所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋，常規(guī)切成厚為4 μm的切片，放入65℃烤箱烤45～60 min；②對切片進(jìn)行脫蠟、水化，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗甲狀腺組織3次，每次持續(xù)5 min；③將漂洗后的甲狀腺癌組織置于200 ml檸檬酸修復(fù)液（pH值=6.0）中，加熱至沸騰，保持沸騰狀態(tài)2 min后冷卻至室溫，然后用PBS將修復(fù)后的甲狀腺癌組織漂洗3次，每次持續(xù)5 min；④3% H2O2去離子水避光靜置10 min，用PBS將阻斷后的甲狀腺癌組織漂洗3次，每次持續(xù)5 min；⑤山羊血清封閉抗體45 min后滴加小鼠抗人CK19單克隆抗體（1∶100）、小鼠抗人Ki-67單克隆抗體（1∶100），以PBS代替一抗作為陰性對照，37℃孵育1～2 h，PBS沖洗3次，每次持續(xù)5 min；⑥滴加羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobuline G，IgG）抗體，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次持續(xù)5 min；⑦二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染色；⑧蒸餾水充分沖洗；⑨脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.3 結(jié)果判讀及標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)染色強(qiáng)度以及高倍鏡下陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行分析。CK19表達(dá)結(jié)果：每張切片均選取5個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。陽性細(xì)胞所占比例：無陽性細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)記分結(jié)果相加，0分為陰性（-），1～3分為弱陽性（+），4～5分為中等強(qiáng)度陽性（++），6～7分為強(qiáng)陽性（+++），4分及以上為高表達(dá)。Ki-67以細(xì)胞核染為淡黃至棕黃色定義為陽性細(xì)胞，計(jì)算Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即為Ki-67增殖指數(shù)，將其分為4組：一組（-）為＜1%，二組（+）為1%～3%，三組（++）為3.1%～5%，四組（+++）為＞5%；以Ki-67增殖指數(shù)＞3%為陽性，Ki-67增殖指數(shù)＞5%為高表達(dá)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK19、Ki-67在116例PTMC組織中的染色結(jié)果

116例PTMC組織中CK19、Ki-67的陽性表達(dá)率分別為87.9%、91.4%。CK19陽性細(xì)胞呈淡黃色、棕黃色、棕褐色，Ki-67陽性細(xì)胞呈棕黃色、棕褐色（圖1）。

圖1 CK19、Ki-67在PTMC 組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

2.2 不同臨床特征的PTMC患者的PTMC組織中CK19、Ki-67蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、腫瘤直徑、病灶數(shù)目及包膜侵犯情況的PTMC患者的PTMC組織中CK19蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；年齡＜55歲及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者的PTMC組織中CK19蛋白陽性表達(dá)率分別高于年齡≥55歲及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.407、5.269，P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數(shù)目及包膜侵犯情況的PTMC患者的PTMC組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者的PTMC組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.379，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的PTMC患者的PTMC組織中CK19、Ki-67蛋白表達(dá)情況（n=116）

3 討論

CK19是一種特殊的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞角蛋白家族中的一員，主要表達(dá)于機(jī)體的單層上皮細(xì)胞，當(dāng)這些細(xì)胞惡變出現(xiàn)惡性增殖后，CK19的表達(dá)明顯增加，所以對腫瘤的鑒別及診斷有一定的意義，因此CK19一直受到廣大學(xué)者們的廣泛關(guān)注，成為近年來研究的熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，CK19對甲狀腺癌有診斷價(jià)值[8]。

Dencic等[9]通過分析147例PTC中CK19蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CK19蛋白高表達(dá)與性別、年齡、病灶數(shù)目、包膜侵犯等臨床特征存在顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果與其相反，PTMC患者CK19的表達(dá)與性別、腫瘤直徑、病灶數(shù)目及包膜侵犯等無關(guān)（P＞0.05），而與年齡存在差異（P＜0.05），年齡＜55歲的患者CK19的陽性率為98.8%（80/81），高于年齡≥55歲患者的62.9%（22/35）。出現(xiàn)該差異的原因可能是因?yàn)镃K19蛋白的表達(dá)與研究人群生活的地域和種族相關(guān)。

目前，關(guān)于CK19的表達(dá)與PTMC轉(zhuǎn)移、預(yù)后的相關(guān)性還存在爭議。Kaliszewski等[10]回顧性分析了西里西亞地區(qū)135例女性和14例男性PTC患者的臨床和組織病理學(xué)資料，認(rèn)為CK19的陽性表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。張進(jìn)權(quán)等[11]通過檢測127例PTC組織和30例癌旁組織中CK19蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CK19的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果與張進(jìn)權(quán)等[11]的結(jié)果較一致，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者的CK19陽性表達(dá)率為96.3%（52/54），高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的80.6%（50/62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明CK19表達(dá)與PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，對預(yù)測PTMC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較高的參考價(jià)值。

Ki-67是細(xì)胞復(fù)制過程中必需的一種核蛋白，出現(xiàn)在細(xì)胞復(fù)制的各個(gè)時(shí)期，除細(xì)胞靜止期（G0期）[12]。Ki-67水平高低與惡性腫瘤細(xì)胞分化程度、侵襲性以及遠(yuǎn)期預(yù)后緊密相關(guān)，因此被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床分期以及遠(yuǎn)期預(yù)后評價(jià)。Zhou等[13]通過分析108例PTMC患者和50例甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者的Ki-67表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，PTMC中Ki-67的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤位置等因素?zé)o關(guān)。本研究結(jié)果與其研究結(jié)果較一致，Ki-67表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數(shù)目及包膜侵犯等臨床特征無關(guān)。

既往研究表明Ki-67蛋白表達(dá)可能與乳頭狀癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Miyauchi等[14]將入組的390例PTC患者按照Ki-67的表達(dá)情況分為＜5%、5%～10%、＞10%3組，發(fā)現(xiàn)Ki-67蛋白陽性表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，認(rèn)為Ki-67蛋白表達(dá)可能參與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者Ki-67陽性表達(dá)率為98.1%（53/54），高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的85.5%（53/62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明Ki-67陽性的PTMC可能具有較強(qiáng)的侵襲能力，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

綜上所述，CK19、Ki-67在PTMC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，二者的表達(dá)與PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷臨床進(jìn)展的重要指標(biāo)。本研究為回顧性研究，樣本量偏少，可能需要進(jìn)一步增加樣本量以確認(rèn)結(jié)論。