Ki-67、B細胞淋巴瘤/白血病-6在彌漫大B 細胞淋巴瘤中的表達及與患者臨床特征和預后的關系

張靜，顏麗華，許偉，徐志陽，丁現超

鄭州頤和醫院血液內科，鄭州 450018

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是成年人最常見的惡性淋巴瘤之一，分為生發中心型（germinal center B cell，GCB）與非生發中心型（non-germinal center B cell，non-GCB）[1]。DLBCL病理上以彌漫性分布的惡性大B淋巴細胞為特征，病情嚴重者可危及生命[2]。及時治療可改善患者的生活質量并延長生存期，但由于DLBCL為一組異質性疾病，其臨床特征、組織學、免疫表型、細胞遺傳學和分子遺傳學在不同患者間存在差異，患者在治療過程中產生的反應及預后也各有不同，因此，對DLBCL發生、發展及預后相關指標進行研究成為熱點問題[3]。

Ki-67是一種核蛋白，與核糖體RNA轉錄有關，可作為細胞增殖活躍度的敏感指標[4]。原癌基因B細胞淋巴瘤/白血病-6（B cell lymphoma/leukemia-6，Bcl-6）蛋白是一種凋亡抑制因子，其功能與Ki-67相似，受Bcl-6調控的靶基因主要與細胞活化、分化和增殖相關[5]。本研究探討Ki-67、Bcl-6在DLBCL中的表達及與患者臨床病理特征及預后的關系，為臨床診斷和治療提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年10月在鄭州頤和醫院初治的DLBCL患者。納入標準：均行淋巴結活檢，并常規行免疫組織化學染色確診為DLBCL；生存期＞6個月；臨床資料完整。排版標準：合并壞死性淋巴結炎、傳染性單核細胞增多癥、轉移性腫瘤及髓外白血病等疾；合并嚴重惡病質、免疫系統等重要系統及器臟功能不全。依據納入和排除標準，本研究共納入71例DLBCL患者，其中男39例，女32例；年齡24～70歲，中位年齡52.5歲，≥60歲31例，＜60歲40例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期36例；乳酸脫氫酶（lactic acid dehydrogenase，LDH）水平：正常37例，增高34例；原發部位：淋巴結內45例，淋巴結外26例；國際預后指數（international prognostic index，IPI）0～1分41例，≥2分30例；Hans分型：GCB-DLBCL 43例，non-GCB-DLBCL 28例；近期療效：完全緩解（complete response，CR）+部分緩解（partial response，PR）41例，疾病穩定（stable disease，SD）+疾病進展（progressive disease，PD）30例。取 71例 DLBCL患者的DLBCL組織及其相應的癌旁正常組織。

1.2 免疫組化法檢測Ki-67、Bcl-6蛋白的表達情況

取DLBCL組織及其相應的癌旁正常組織制作成蠟塊連續切片，厚4～5 μm，放入80℃烤箱中烤片30 min后經二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；切片經檸檬酸緩沖液煮沸法修復抗原，冷卻后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗；然后用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性；切片滴加鼠抗人但克隆抗體（一抗），4℃下孵育過夜；PBS緩沖洗切片后滴加通用型免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體，37℃孵育15 min；PBS沖洗后采用現配二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑染色，蘇木素輕度復染細胞核沖洗脫水干燥后，中性樹膠封片，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 判定標準

以腫瘤細胞內出現定位清晰的棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，Bcl-6采用定性判斷，隨機選取10個高倍視野，根據著色強度和視野中陽性細胞所占比例進行評分[6]，著色強度：無著色計0分；淺黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3分；陽性細胞所占比例評分：＜25%計1分，25%～50%計2分，＞50%計3分。將著色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘：0～1分為陰性（-），2～4分弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分強陽性（+++），陰性和弱陽性為低表達，中等陽性和強陽性為高表達。Ki-67采用定量判定方法，將陽性細胞所占比例≥50%作為高表達（≥75%為強陽性表達），＜50%作為低表達。所有病理結果均經2名以上病理學專家復核。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，DLBCL患者預后的影響因素采用Logistic回歸模型分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67、Bcl-6蛋白表達情況的比較

DLBCL組織中Ki-67、Bcl-6蛋白高表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 DLBCL組織和癌旁正常組織中Ki-67、Bcl-6蛋白表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征DLBCL患者DLBCL組織中Ki-67、Bcl-6蛋白表達情況的比較

不同性別、年齡、LDH水平、原發部位、IPI和Hans分型DLBCL患者DLBCL組織中Ki-67蛋白表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、IPI≥2和近期療效為SD+PD的DLBCL患者DLBCL組織中Ki-67蛋白呈高表達，差異均有統計學意義（χ2=9.779、4.709、7.790，P＜0.05）。不同性別、年齡、原發部位、IPI和近期療效DLBCL患者DLBCL組織中Bcl-6蛋白表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期、正常LDH水平及GCB型DLBCL患者DLBCL組織中Bcl-6蛋白呈高表達，差異均有統計學意義（χ2=9.694、4.611、7.647，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征DLBCL患者Ki-67、Bcl-6蛋白的表達情況

2.3 預后情況的比較

治療后，對所有患者隨訪3年，隨訪截止2019年10月30日。Ki-67蛋白高表達DLBCL患者的平均生存期分別為（31.49±1.70）個月，低于低表達DLBCL患者的（44.25±2.38）個月，差異有統計學意義（t=22.07，P＜0.01）；Bcl-6蛋白高表達DLBCL患者的平均生存期為（45.33±1.49）個月，高于低表達DLBCL患者的（25.23±2.01）個月，差異有統計學意義（t=41.13，P＜0.01）。（圖1、圖2）

圖1 Ki-67蛋白高表達（n=59）和Ki-67蛋白低表達（n=12）DLBCL 患者的生存曲線

圖2 Bcl-6蛋白高表達（n=58）和Bcl-6蛋白低表達（n=13）DLBCL 患者的生存曲線

2.4 DLBCL 患者預后影響因素的單因素分析

隨訪3年，71例DLBCL患者生存38例，單因素分析結果顯示，不同年齡、性別和原發部位DLBCL患者3年生存率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同臨床分期、LDH水平、Hans分型、IPI、Ki-67蛋白表達情況和Bcl-6蛋白表達情況DLBCL患者3年生存率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

2.5 DLBCL 患者預后影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統計學意義的臨床分期、LDH水平、Hans分型、IPI、Ki-67蛋白表達情況和Bcl-6蛋白表達情況作為自變量，DLBCL患者的生存情況作為因變量納入非條件多因素Logistic回歸模型分析，結果顯示，臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、Hans分型為non-GCB型、Ki-67蛋白高表達、Bcl-6蛋白低表達是DLBCL患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表 4）

3 討論

DLBCL是淋巴瘤分類中發病率最高的亞型，其異質性較大，且具有較寬的細胞譜系，且常常起病兇險，嚴重威脅患者的生命健康[7]。化療是DLBCL的主要治療手段，誘導化療病情緩解后實施鞏固化療、放療聯合自體造血干細胞移植可以明顯提高患者的長期生存率和總生存率[8]。相關研究顯示，40%～50%的DLBCL患者經有效治療后近期生存率明顯提高，本研究生存分析結果顯示，Ki-67蛋白低表達和Bcl-6高表達DLBCL患者的生存期較長，與既往研究結果類似。但仍存在部分死亡病例，且部分患者緩解后可出現復發，因此，本研究探討Ki-67、Bcl-6的表達與DLBCL患者臨床病理特征和預后的關系。

表3 DLBCL患者預后影響因素的單因素分析

表4 DLBCL患者預后影響因素的多因素分析

Ki-67是一種非組蛋白性核蛋白，主要存在于增殖細胞核中[9]。Ki-67在細胞增殖的G1、S、G2和M期中均有表達，但在靜止的G0期不表達[10]。Ki-67在細胞不同分裂階段表達情況不同的特點，對反映細胞分裂和增殖狀態有重要意義，可將其作為評估腫瘤生長增殖情況的敏感指標。本研究顯示，DLBCL組織中Ki-67的高表達率達83.10%，明顯高于癌旁正常組織的9.86%，與DLBCL屬于侵襲性腫瘤密切相關。進一步研究Ki-67與DLBCL患者預后的關系發現，Ki-67蛋白高表達DLBCL患者的平均生存期為（31.49±1.70）個月，低于低表達DLBCL患者的（44.25±2.38）個月，這可能是因為腫瘤組織中凋亡細胞增多，導致更多的周圍細胞進入增殖周期，進而使G0期細胞比例減少，導致Ki-67蛋白高表達[11]。而Ki-67蛋白高表達率的升高從側面反映了腫瘤的快速增殖及低組織分化[12]。

原癌基因Bcl-6位于3q27染色體，可編碼一個鋅指蛋白，主要促進淋巴細胞分化和生發中心形成[13]。Bcl-6蛋白主要表達于正常的濾泡生發中心B細胞和CD4+T細胞，可抑制B淋巴細胞的終末分化[14]。本研究顯示，DLBCL組織中Bcl-6蛋白的高表達率為81.69%，分析其原因可能與體細胞的突變有關。陳文婷等[15]通過對163例初診DLBCL患者的臨床資料進行回顧性分析，結果發現，Bcl-6的表達水平與DLBCL患者總生存期和無進展生存期明顯相關。本研究結果顯示，不同年齡、性別和原發部位DLBCL患者3年生存率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同臨床分期、LDH水平、Hans分型、IPI、Ki-67蛋白表達情況和Bcl-6蛋白表達情況DLBCL患者3年生存率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。進一步多因素分析發現，Ki-67蛋白高表達、Bcl-6蛋白低表達是DLBCL患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。此外，本研究還對其他影響DLBCL患者預后的獨立危險因素進行研究，結果顯示，臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、Hans分型為non-GCB型是DLBCL患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。這可能是因為Ki-67、Bcl-6蛋白的異常表達可影響腫瘤細胞增長、凋亡，導致患者出現不同臨床分期、癥狀從而影響預后，這些指標在一定程度上可作為評估DLBCL患者預后的指標。

綜上所述，Ki-67、Bcl-6在DLBCL患者中高表達，其表達水平與患者臨床病理特征及預后密切相關；臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、Hans分型為non-GCB型、Ki-67蛋白高表達、Bcl-6蛋白低表達是DLBCL患者預后的獨立危險因素，可作為預測患者預后的有效指標。