甘肅、青海地區小麥條銹菌監測及群體遺傳多樣性分析

黃苗苗，陳萬權，曹世勤，孫振宇，賈秋珍，高利，劉博，劉太國

（1甘肅農業大學植物保護學院，蘭州730070；2中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3農業農村部農產品質量安全生物性危害因子（植物源）控制重點實驗室，北京 100193；4農業農村部國家植物保護甘谷觀測實驗站，甘肅甘谷741200；5甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州730070）

0 引言

【研究意義】小麥條銹病是一種氣傳病害，是危害我國小麥生產的主要流行病害之一，在世界各主要麥區也時有發生，其病原菌為條形柄銹菌小麥?；停≒uccinia striiformisf. sp.tritici，Pst）。小麥條銹菌主要在緯度較高或高海拔地區越夏，具有喜涼怕熱、遠距離氣流傳播、分布范圍廣、流行頻率高、暴發性強、流行速度快、危害程度重等特點[1]。該病害流行時，可造成10%—70%的產量損失，嚴重時可至絕收[2-3]，長期威脅著我國小麥主產區，包括西北、西南、黃淮海和長江中下游地區。新中國成立以來，小麥條銹病在我國年均發生400萬公頃左右，特別是1950、1964、1990、2002和2017年的5次大流行，小麥產量損失達1 380萬噸[4]。我國小麥條銹病的病菌來源分為秋季菌源基地和春季菌源基地，秋季菌源基地為甘肅隴南隴東、川西北、青海東部等，向條銹病菌冬繁區秋苗提供菌源[5]。前人在甘肅小麥條銹菌流行關系研究中，對與青海菌源的關系少有涉及，沒有將甘肅和青海的菌源作為研究主體，存在樣本量較小、條銹菌的標樣未采集于病害流行初期等缺陷。因此，明確甘肅、青海兩省春季流行期間的菌源傳播以及生殖方式對條銹菌大區流行預測及確定越夏初始菌源來源等具有重要意義。【前人研究進展】我國西北、華北、西南主要流行區的條銹菌群體遺傳多樣性和遺傳結構已進行了廣泛而深入的研究，確定了我國小麥條銹菌具有較高的遺傳多樣性水平，尤其是甘肅隴南地區，不同流行區群體間存在著一定的基因交流[6-11]。西北地區的甘肅和青海是我國小麥條銹菌最重要的越夏區，條銹菌新小種的首次發現幾乎均在這一區域。該區域秋季條銹菌菌源可向東部廣大冬麥區傳播，對周邊地區有重要影響[1]。關于青海、甘肅、新疆、西藏4省（自治區）的小麥條銹菌毒性及遺傳多樣性的研究表明，青海和甘肅的條銹菌群體相似性較高，存在一定的菌源交換關系[12]。青海與甘肅條銹菌群體的菌源交流主要存在于隴南地區，基因流較強；與臨夏群體的菌源交流則受到一定程度的限制，基因流相對較弱[10]。因此，學者們多認為青海春季、夏季菌源全部由甘肅隴南傳播到青海[13]。【本研究切入點】雖然前人對甘肅、青海地區小麥條銹病做了相關研究，但關于小麥條銹菌在甘肅、青海地區周年循環的研究，包括越夏、越冬以及春夏季菌源傳播，特別是春季流行期間甘肅、青海菌源傳播以及兩地可能存在的生殖模式等問題，尚缺乏一些直接的證據?！緮M解決的關鍵問題】以采自自然發病條件下甘肅、青海地區小麥變異觀察圃材料上的小麥條銹菌群體為對象，利用微衛星（simple sequence repeat，SSR）分子標記的方法研究甘肅和青海兩省6個市（縣）小麥條銹菌春季流行傳播路線及群體遺傳多樣性和群體的生殖模式，闡明甘肅和青海兩省小麥條銹菌的群體遺傳關系，明確兩省小麥條銹菌之間的傳播流行關系及菌源交換規律，進而為兩省小麥條銹病的預測預報、確定越夏初始菌源來源和有效治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗點及標樣采集

選擇歷年種植小麥、條銹病常發生的地區作為調查和研究區域。甘肅省共4個試驗點：隴南市文縣、隴東平涼市崆峒區、中部麥區定西市臨洮縣、臨夏州臨夏縣；青海省2個試驗點：西寧市城北區、海東市互助縣。

供試6套82份小麥品種組成的抗病性變異觀察圃材料由中國農業科學院植物保護研究所麥類真菌病害研究組提供，根據各地小麥播種適期，按照編號順序依次種植在試驗田中。每個小麥材料種植1行，行長2 m，行距0.33 m，每隔一段距離（一般18行）設置當地抗、感病品種各1行作為對照。在試驗區周圍播種2—3行銘賢169（高度感染條銹病品種）作為誘發品種。種植管理按照當地大田常規栽培管理方法進行，同時注意以下幾點：（1）保持水肥適中，防止土壤干旱和植株倒伏；（2）小麥生育期內禁用任何殺菌劑；（3）不可進行人工接種，并盡可能遠離接種試驗地；（4）觀察記載自然發病結果（始發期、盛發期）及各品種的小麥生長狀況。

標樣采集：從6個試驗點82份變異觀察圃上共收集到551份始發期小麥條銹病標樣（表1）。每個試驗點調查病害的普遍率、嚴重度和反應型[14]并采集條形柄銹菌夏孢子堆之間分界明顯，無其他病原菌污染的葉片作為發病標樣，用單張吸水紙包裹葉片，并單個放入干燥的信封中，對每個信封進行編號，并標明地名（市、縣、鄉鎮）、小麥品種及采集時間，帶回實驗室后4℃干燥器中保存備用。

表1 甘肅、青海兩省6個觀察圃內小麥條銹病自然發病調查結果及采集的551份標樣信息Table 1 The collection information of the 551 Pst samples from six regions in Gansu and Qinghai provinces and the incidence results under the natural infection by Pst

續表1 Continued table 1

續表1 Continued table 1

1.2 小麥條銹菌基因組 DNA的提取及微衛星位點的PCR擴增

對采集到的小麥條銹菌標樣，小心將單一病斑剪下裝入2 mL離心管中，按采集地點和品種進行編號，試驗過程要嚴防交叉污染?；蚪MDNA的提取參照天根植物 DNA提取試劑盒的方法進行，使用Nano Drop（ND-1000，USA）測量DNA的濃度，并將 DNA濃度稀釋至 50 ng·μL-1后置于-20℃冰箱保存備用。

用于SSR分子標記的15對引物[2,15]（表2）均由上海生工合成。PCR反應體系及程序參照文獻[2,15]，對擴增產物進行 2%的瓊脂糖凝膠電泳后篩選符合要求的反應產物，使用3500XL Genetic Analyzer（Applied Biosystems，USA）對擴增子進行檢測。

表2 本試驗使用的15對SSR小麥條銹菌引物信息Table 2 Information of the 15 SSR primers for Pst used in this study

3500XL Genetic Analyzer上機前的準備：按照1∶50的比例對PCR產物進行稀釋，吸取1 μL稀釋液加入9 μL的Hi-Di+Liz混合液（Hi-Di∶Liz = 1 000∶15），混勻后全部加入3500XL Genetic Analyzer配套的96孔板中，貼膠貼，在振蕩儀上充分混勻后，2 000 r/min離心1 min收集待測反應液于管底，95℃變性5 min，冰浴5 min，隨后上機。

1.3 數據處理

擴增子長度由3500XL Genetic Analyzer（Applied Biosystems，USA）檢測分析后，用GeneMaker（V2.7.0）（Soft Genetics）讀取數據。然后將數據按照二倍體的格式錄入Excel表，利用GenAlEx 6.5[16]將數據轉化為可供R軟件POPPR v2.5.0分析的CSV數據格式，超過一半位點有缺失數據的樣品去除。

利用GenAlEx計算以下遺傳參數：（1）分子方差分析（analysis of molecular variation，AMOVA）；（2）群體遺傳分化系數（FST）；（3）基因流（gene flow value，Nm）。

利用 POPPR v2.5.0[17]計算以下參數：（1）觀察到的等位基因數量（Na）；（2）均勻度（Evenness）；（3）位點缺失比率（locus missing ratio）；（4）每個采樣試驗點的樣本個數（N）；（5）特定個體在特定位點上攜帶的等位基因的組合，攜帶相同等位基因組合的個體稱為具有相同的多位點基因型（multi locus genotype，MLG）；（6）基因型多樣性（G）；（7）標準化關聯指數（rbarD）[18]；（8）基因型累積曲線（genotype accumulating curve）：反映位點是否足以進行群體分析，基因型累積曲線達到 100%，代表所選擇的位點數足夠進行群體分析[19]；（9）采用Bruvo’s distance繪制不同個體間的最小時空網絡圖（minimum spanning networks，MSN）[20]；（10）主成分判別分析（discriminant analysis of principal components，DAPC）[21]。

(2)根據基巖面等值線圖及現場地面調查可知場地溶洞、溶槽、石芽、漏斗等巖溶形態造成穩定持力層判斷較困難；易出現部分基礎位于隱伏陡崖上等不利情況。

2 結果

2.1 甘肅、青海地區6個試驗點小麥條銹病監測

田間調查結果顯示，82份全國變異觀察圃材料在甘肅地區發病比青海地區嚴重，其中在臨夏地區發病材料最多（54份），其次是平涼（44份）、臨洮（40份）和文縣（13份）；有11份材料（Triticum speltaalbum、Joss Cambier、Armada、川育 23、Avocet S*/Yr24、Avocet S*/Yr26、Jupateco R Yr18、TcLr38、ISr6 Ra、ISr11 Ra、Trident Sr38）在6個地區均未發病，占供試材料的13.41%，其余71份材料至少在1個試驗點發??；青海互助 14份材料發病，西寧僅 4份材料發病；青海地區發病的18份材料僅1份材料（銘賢169）在甘肅4個地區都發病，其他17份材料均未在甘肅文縣發病，但在平涼和臨夏地區部分材料發?。ū?1），顯示文縣和青海群體小麥條銹菌毒性有一定差異。

2.2 小麥條銹菌遺傳多樣性水平

15對引物組合共擴增出81個位點，每對引物組合產生的多態性位點為2—12個。均勻度值在0.2719—0.8648，表明等位基因頻率在樣本之間分布不均，其中引物RJ21的均勻度接近0.5，即該引物的等位基因在樣本中均等分布。各個位點的缺失比率在 0—9.62%（表3）。

表3 15對引物的遺傳多樣性信息Table 3 Information of genetic diversity about 15 SSR primers

551份樣本克隆矯正后，共鑒定出505個MLG，甘肅和青海群體總的基因型多樣性（0.917）高，群體的基因型多樣性在 0.841—0.974，其中平涼群體的基因型多樣性最高，互助群體次之，甘肅臨洮群體的最低（表4），可以看出，6個群體的基因型多樣性均比較高。

2.3 甘肅與青海小麥條銹菌群體菌源關系

在505個MLG中（表4），僅有32個MLG被克隆并進行了2—6次重新采樣，各群體內部均檢測到重新采樣的MLG。甘肅、青海群體分別有29和3個MLG被重新采樣，其中MLG-184在臨洮的群體中重新采樣6次，MLG-141在臨夏的群體中重新采樣5次，沒有重新采樣的MLG有473個，表明甘肅和青海小麥條銹菌群體中存在明顯的遺傳差異，MLG多樣性與小麥條銹菌流行期的主要無性繁殖模式形成了明顯的對比，即無性繁殖在群體中所占的比例不高。

青海西寧群體與甘肅平涼群體之間的基因流最大，臨夏次之，表明西寧群體與平涼群體菌源交流最頻繁，與臨夏群體菌源交流較頻繁；其與文縣和臨洮群體的基因流小且群體遺傳分化系數大（0.234和0.246），說明西寧群體與文縣、臨洮群體之間有較大的遺傳分化，菌源之間交流不頻繁。青?；ブ后w與臨夏群體之間基因流最大，菌源交流最頻繁；與文縣群體之間基因流最小且群體遺傳分化系數最大，說明互助群體與文縣群體之間遺傳分化大，菌源交流不頻繁?？赏茢啵嗪５貐^小麥條銹菌的菌源大多數來源于甘肅平涼和臨夏地區的傳播。甘肅的4個群體之間，平涼群體與臨夏群體之間的基因流最大，菌源交流最頻繁（表5）。

表4 重采基因型及克隆校正群體的基因型多樣性統計Table 4 Resampled MLGs and genotypic diversity statistics of the clone-corrected data within all populations examined in this study

表5 甘肅和青海兩省6個小麥條銹菌群體成對的群體遺傳分化系數（對角線下部）和基因流（對角線上部）Table 5 Pairwise population FST values (lower diagonal) and Nm (upper diagonal) among six populations of Pst collected from Gansu and Qinghai provinces

最小時空網絡圖（MSN）結果表明，兩省6個群體相互之間未發現共享MLG。臨洮群體的MLG與其他5個群體之間的遺傳關系較小，從而形成了一個獨特的MLG基因簇。甘肅省4個小麥條銹菌群體之間存在不同程度的遺傳變異；西寧群體的 MLG緊密聚集在一起，與甘肅臨夏和平涼群體的部分個體菌源遺傳距離相近，支持菌源從甘肅的臨夏或平涼傳播到西寧，隨后在西寧群體產生了克隆分支。這說明盡管種群內部存在多樣性，但個體親緣關系仍然密切。文縣群體同樣緊密聚集在一起，并與青海西寧群體之間的遺傳距離較遠，來自甘肅臨夏、平涼和青海互助的許多MLG非常接近，表明這些群體之間遺傳關系更密切（圖1）。

同樣，非參數主成分分析（DAPC）驗證了MSN的結果，青?；ブ臀鲗幍娜后w與來自于甘肅平涼和臨夏的群體之間菌源關系最密切，差異最小；與臨洮群體遺傳距離相對較遠且臨洮群體為相對獨立；文縣群體則是一個完全獨立的群體，與其他5個群體之間的差異最大（圖 2）。DAPC的結果以及群體間較大的 FST（0.131）（表 6）再次說明小麥條銹菌各群體之間存在遺傳變異。

圖1 根據Bruvo’s距離進行的所有小麥條銹菌分離株的最小網絡圖Fig. 1 Minimum spanning network (MSN) of all isolates of Pst based on Bruvo’s distance

圖2 不同小麥條銹菌群體主成分判別分析圖Fig. 2 The discriminant analysis of principal components (DAPC) of different Pst populations

2.4 甘肅、青海小麥條銹菌群體繁殖方式分析

結果顯示，等位基因與個體以及群體之間的基因座相關聯這一假說得到了重要支持，整體上甘肅和青海小麥條銹菌群體表現出無性繁殖特征（表 4）。而來自于甘肅文縣、臨夏的群體以及青海西寧的群體具有與其他地區群體不同的特征，這3個群體存在不顯著的rbarD值（表4、圖3）表示連鎖平衡，可能是有性生殖群體，尤其文縣群體（rbarD=0.0139，P=0.186）顯示出明顯的有性重組特征，其他3個群體均為無性繁殖模式。

圖3 甘肅、青海3個小麥條銹菌有性群體連鎖不平衡分析Fig. 3 Linkage disequilibrium analysis of three Pst populations from Gansu and Qinghai

3 討論

甘肅、青海地處西北內陸，地域遼闊，地形地貌復雜多樣，區域間氣候差異大，形成了小麥種植呈垂直分布，冬、春小麥成片交錯種植的農田生態景觀，是小麥條銹病周年流行的適宜場所，使其成為我國小麥條銹菌重要的越夏區。小麥條銹菌除了在甘肅、青海區域內往返傳播循環外，還通過孢子的遠程傳播危及到我國東部廣大麥區[1]。條銹菌的遠距離傳播一直是植物病害流行學中的熱點研究領域之一，為大區病害流行規律的研究提供了極具價值的材料，也極大地豐富了流行學理論，可從根本上提供地域性病害防治與品種抗病性布局的科學依據。因此通過分子標記方法明確甘肅、青海小麥條銹菌傳播及遺傳多樣性水平，對該地區小麥條銹病的準確預測和指導防治具有重要作用。

表6 甘肅、青海兩省6個小麥條銹菌群體分子方差分析Table 6 Analysis of molecular variance (AMOVA) for six populations of Pst sampled from Gansu and Qinghai provinces

本研究中，春季流行時小麥條銹菌在甘肅和青海之間存在廣泛的基因交流。根據田間實地調查條銹病初始發病時間，甘肅4個地區比青海2個地區發病早，且發病程度嚴重。最小時空網絡圖和主成分判別分析結果顯示甘肅省4個群體之間，文縣和臨洮群體是2個相對獨立的群體，臨夏和平涼群體菌源關系最近，交流最頻繁，且平涼地區發病時間早于臨夏，兩群體之間存在很大的基因流，可推斷菌源從平涼傳播到臨夏，然后進行繁殖存活。文縣群體和其他群體不同的原因主要是甘肅省春季發病初始菌源不同，甘肅省春季菌源結構復雜，有來自于甘肅省本地的越冬菌源，也有其他地方的菌源。2018年4月中旬，筆者在甘肅省春季病害實地調查中發現與隴南文縣相鄰的陜西漢中寧強、略陽的小麥生長期為灌漿期，其條銹病已進入暴發期；而甘肅天水、定西地區的小麥僅處于苗期，其條銹病呈始發或未發狀態，平均病田率、病點率和病葉率均輕于陜西寧強和略陽。陜西黃陵以南是條銹菌在西北的主要越冬場所，也是條銹病的春季流行區[1]。另外，前人研究也表明隴南地區菌源可能來自于四川、云南的越冬菌源或陜西的春季流行菌源，而不是當地冬前菌源[22]。同時，隴中、隴東地區小麥種植以甘肅育成小麥品種為主，而隴南以四川及20世紀70年代引進的抗病品種為主[23-24]，差異較大的寄主造成甘肅條銹菌群體出現一定差異。隴南地區在小麥條銹病綜合治理中引進了較多抗病品種，使得小麥群體的抗病基因趨于多樣，并對抗病品種進行合理布局和輪換，所以多元化的寄主抗病基因和較低的選擇壓力也是隴南地區條銹菌群體結構不同的主要成因。

本研究中群體差異主要來自各群體內部個體之間，這與之前研究各流行區群體遺傳分化結果一致[6-8,10]?；蛄鞣磻后w的遺傳分化水平，基因流大表示群體間的遺傳分化小。本研究中，群體間成對的基因流均＞1（表5），表明小麥條銹菌在各群體間有一定的基因交流，與LU等[10]研究不同，未發現6個群體之間共享任何基因型，僅在各個群體內部存在少數基因型重新采樣，青海群體的基因交流不如甘肅群體頻繁，較高的基因型多樣性與小麥條銹菌流行周期的主要克隆性形成了明顯的對比。

青?；ブ臀鲗幦后w與甘肅隴東平涼和隴中臨夏群體菌源之間的基因流要大于其與隴南文縣群體之間的基因流，本研究表明青海的群體與甘肅臨夏、平涼群體之間的遺傳距離比隴南文縣的近，文縣群體是一個相對獨立的群體。青海地區發病的變異觀察圃材料，除了銘賢 169，其他材料均未在隴南文縣地區發病，也是群體有差異的證據之一。而LU等研究認為青海春季菌源主要自隴南地區傳播而來，兩地群體間基因流較強，菌源交流廣泛；與臨夏群體的菌源交流則受到一定程度的限制，基因流相對較弱[10]，這與本研究結果不同。造成本研究結果的原因，一是與各地區的地形地貌特征和區域間距離相關，文縣地區高山林立，山川縱橫，生態環境較為封閉，病菌與外地交流需借助較強的上升氣流和適當的風向才可實現，且氣候溫和，冬季比較溫暖，夏季涼爽，有利于病原菌完成周年循環；二是環境的改變，隨著近年來溫度的升高，菌株發生變異，加之種植制度的變化等原因；三是有性繁殖群體存在的影響?？偟膩碚f，導致隴南文縣地區小麥條銹菌群體遺傳多樣性與其他地區不同的主要因素是地理氣候特征，其次，有性生殖的存在也有一定的影響[10,25-26]。

小麥條銹病為氣傳病害，條銹菌夏孢子在風力作用下可大范圍傳播。其中青?；ブ臀鲗幦后w之間基因交流不頻繁，原因可能是這些地區有一部分菌源來源于青海已發病地區的菌源傳播。在早春病情調查中發現，各地區小麥品種不盡一致，而青海尖扎、貴德地區的小麥條銹病發病時間略早于甘肅臨夏等相鄰地區，青海尖扎地區5月21日初始發病，發病嚴重度和普遍率較低（3/10/10），甘肅臨夏地區6月 16日發病程度（4/40/60） 比尖扎嚴重，青海貴德6月14日發病（4/20/40），青海貴德和尖扎兩地群體菌源來源也不相同。有研究表明，青海一些地區小麥條銹菌可以少量越冬[27]。所以青海春季流行的初始菌源不一定都來自于甘肅省，兩省菌源有一定的交流。由此推斷，青海小麥條銹菌越冬菌源在春季病害流行具有一定的作用。

本研究中，兩省小麥條銹菌群體遺傳多樣性均較高，這與樣本來源于地理跨度較大的不同縣（市）有一定關系，是病菌受復雜多樣生態環境自然選擇的結果[28]。同時，樣本來自不同的變異觀察圃品種，小麥品種擁有多樣化的抗性背景，寄主對病原菌群體結構產生了重新配置的作用[29-30]。另外，甘肅和青海地區是地形相似的自然區域，或為高寒冬春麥區，或為山川交錯、冬春麥垂直分布的麥區，為條銹菌的生長和越夏提供了適宜的氣候條件和生態環境，條銹菌在該地有較長的進化史。因此，這些地區的條銹菌群體有較高的遺傳多樣性和重組事件。6個群體間沒有共享基因型存在，也說明條銹菌可通過遺傳重組、突變、寄主選擇及對當地生態環境的適應，在各地區進行了相對獨立的進化。

根據哈迪-溫伯格定律，無性繁殖的群體由于基因不是完全獨立的遺傳會出現顯著的連鎖不平衡現象，有性生殖的群體因配子的隨機交配使得基因座間在遺傳過程中沒有相關性，處于連鎖平衡狀態。甘肅、青海省6個地區的群體中，甘肅文縣、臨夏的群體以及青海西寧的群體存在連鎖平衡現象（圖 3），說明這些地區存在有性重組的可能。ZHAO等[31]在甘肅省從銹菌侵染的小檗上分離純化的2個銹子器可以產生條銹菌夏孢子，為甘肅小麥條銹菌群體存在有性生殖提供了最直接的證據，前人也報道了甘肅地區存在有性重組現象[9,25-26]。但是關于青海地區存在有性繁殖現象少有報道。青海地區存在大量的轉主寄主小檗[32]，且種類豐富。在5—7月份，青海大多數小檗可在自然條件下受到銹菌侵染，能產生銹子器，并大量分布在冬麥和春麥田邊。青海東部地區廣泛分布的鮮黃小檗、直穗小檗、置疑小檗、甘肅小檗、近似小檗、細葉小檗、匙葉小檗、松潘小檗、堆花小檗和秦嶺小檗10 種小檗可以作為小麥條銹菌的轉主寄主[31,33-34]，這是青海群體可以發生有性生殖的必要條件之一。隨著全球氣候的變暖，耕作制度的變革，青海省東部地區冬小麥種植面積不斷擴大，使得小麥條銹病的發生流行規律發生顯著變化。甘肅和青海小檗種類繁多，為小麥條銹菌有性生殖發生提供了基礎條件。本研究發現青海西寧地區可能存在有性生殖，群體具有很高的遺傳多樣性，趙杰等研究表明青海地區小檗分布較為廣泛，春季小檗銹病發生非常嚴重[35]，但目前尚未確定青海其他地區是否存在小麥條銹菌的有性生殖，需要結合更大的樣本量和更多的采樣點進一步深入研究證實。

4 結論

小麥條銹病春季流行期，甘肅和青海群體均具有較高的基因型多樣性，甘肅地區與青海東部地區的傳播路線以甘肅平涼、臨夏到青海的傳播為主，甘肅文縣到青海的傳播為輔。甘肅文縣、臨夏和青海西寧 3個群體存在有性生殖現象，對該地區條銹菌豐富的遺傳多樣性的形成具有一定作用。