人溶菌酶密碼子優化及其在牛乳腺細胞中高效表達

田媛，王力，龍鳳，昝林森,2，成功,2

（1西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

0 引言

【研究意義】抗生素濫用所引發的細菌耐藥性、抗生素殘留及食品安全等問題已被視為全球危害公眾健康的問題，人們迫切需要開發新型廣譜抗菌劑。溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，在唾液、淚液、血清、人乳、牛乳和禽類蛋清中廣泛分布，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，具有廣譜抗菌、消炎、抗病毒及免疫調節等多種功效，在畜牧、農產品、食品和醫療等行業廣泛應用[1-3]。人溶菌酶和雞蛋清溶菌酶氨基酸序列具有59%同源性，但抗菌活性遠高于目前使用較廣的雞蛋清溶菌酶，具有更廣闊的應用前景[4]。然而，通過傳統方法從母乳、胎盤、唾液中提取分離或微生物表達系統生產重組人溶菌酶，獲得量很少，穩定性低，無法滿足研究和潛在市場應用的需求[5]?；蚬こ滩粩喟l展為大規模高效生產重組人溶菌酶提供了可能。因此，進一步優化表達系統，通過生物反應器實現重組人溶菌酶高效表達，將為今后重組人溶菌酶的工業化生產和應用奠定基礎?！厩叭搜芯窟M展】2006年，MEGA首次利用山羊乳腺生物反應器生產了重組人溶菌酶[6]，隨后在牛[7-9]、豬[10]、山羊[11]等動物的研究中均有成功實現了重組人溶菌酶在乳腺中表達的報道。然而，不容忽視的是，異源重組蛋白表達量低是目前生物反應器中亟待解決的難題。研究發現，宿主細胞密碼子使用偏好很大程度上影響了異源重組蛋白在宿主細胞的高效表達[12]。組成蛋白質的氨基酸有 20種，而編碼氨基酸的密碼子有64種（簡并密碼子）。不同生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其中使用頻率高密碼子稱為最佳密碼子，而那些很少被利用的密碼子稱為稀有或低頻密碼子。研究發現，少量的 DNA密碼子的改變，在很大程度上影響了蛋白翻譯速率，即使替換單個簡并密碼子，其蛋白合成的速度會減緩到其正常速度的1/10甚至更慢[13]，密碼子使用偏好與蛋白翻譯效率呈顯著正相關[14]。通過蛋白質和mRNA表達數據庫聯合分析發現，密碼子的選擇決定了蛋白的表達量，生物體通過密碼子的選擇進而調控內源蛋白的表達豐度[15]。密碼子的選擇在生物反應器研究過程中十分重要，外源基因含有宿主細胞基因使用的低頻密碼子或者偏好密碼子不一致情況下，往往會影響外源基因的mRNA的穩定性和翻譯效率，造成重組蛋白表達量低[16]。前人研究結果比較發現，轉基因山羊、牛乳腺中重組人乳鐵蛋白表達量為 1.5—30 g·L-1，而重組人溶菌酶的表達量只有0.025—0.27 g·L-1[17]，表達量低造成提純成本高，難以達到乳腺生物反應器工業化生產要求?！颈狙芯壳腥朦c】因此，人溶菌酶基因密碼子使用偏好性是否與牛主要乳蛋白密碼子使用偏好一致？這種差異是否是導致人溶菌酶在乳腺生物反應器中表達量低的主要原因？密碼子優化能否進一步提高重組人溶菌酶表達量？這些問題仍待進一步研究?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過對牛乳腺主要乳蛋白密碼子使用偏好性進行分析，并根據牛乳蛋白高頻密碼子和低頻密碼子對人溶菌酶基因密碼子進行翻譯起始區優化和全局優化設計，通過熒光素酶、實時熒光定量PCR及Western-blot等方法從mRNA和蛋白水平對密碼子優化效果進行分析比較，實現人溶菌酶基因的高效表達，為開展重組人溶菌酶的工業化生產及應用奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于 2019年在西北農林科技大學國家肉牛改良中心實驗室完成。

1.1 材料

PGL3-Basic熒光素酶載體、海腎熒光素酶載體為實驗室保存。E.coliDH 5a菌株和pMD19-T easy載體購自大連Takara公司。牛成纖維細胞通過耳組織塊法分離獲得，實驗室凍存。牛乳腺上皮細胞系購自通派（上海）生物科技有限公司，小鼠乳腺上皮細胞系C127購自北京協和細胞庫。主要試劑包括：高保真PCR酶、限制性內切酶、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒和SYBR Premix EX Taq定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA連接酶、Dual-Glo雙熒光素酶檢測試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；Endo-free Plasmid Kit、膠回收試劑盒購自Omega Biotek股份有限公司；Lipo3000轉染試劑及 opti-MEM 購自Invitrogen公司；Western-blot細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏公司。兔源溶菌酶多抗、兔源GAPDH單抗和HRP標記的羊抗兔二抗分別購自Santa Cruz（sc-292849），Abcam（ab181603）和生工生物工程（上海）股份有限公司（D110058）。

1.2 牛主要乳蛋白基因和人溶菌酶基因密碼子使用偏好分析

選取 αs1、αs2、β、κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清白蛋白，乳鐵蛋白等7種牛乳中主要乳蛋白基因CDS序列，用于密碼子使用偏好性分析。具體乳蛋白基因名稱、GenBank登錄號、CDS序列長度見表1。

表1 7種牛乳蛋白基因GenBank登錄號及序列信息Table 1 GenBank accession number and sequence information of cattle seven milk protein genes

利用 CodonW1.42和 EMBOSS（http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/）中CUSP、CHIPs等工具對牛主要乳蛋白基因密碼子及人溶菌酶密碼子使用特性進行分析。分析的特性參數主要包括：A3s，G3s，C3s，同義密碼子在第 3 位上相應堿基的出現頻率（T3s）、基因的G+C含量（GC）、密碼子第3位的G+C 含量（GC3s）、密碼子適應性指數（CAI）、有效密碼子數（ENc）等。同義密碼子的相對使用度（RSCU）是對同義密碼子的使用偏好性評估，該值等于同義密碼子的實際觀測值與同義密碼子平均使用期望值的比值。如果密碼子使用無偏好性，則RSCU值為1；如該密碼子比其他同義密碼子使用更頻繁，則其 RSCU值大于1，反之亦然。將7個牛乳蛋白基因和人溶菌酶基因各自作為一個對象，以密碼子的RSCU 值作為變量，對應每個編碼氨基酸密碼子利用TBtools 0.665繪制熱圖并進行聚類分析。

1.3 溶菌酶密碼子優化及基因克隆

根據牛主要乳蛋白基因密碼子使用偏好性，對人溶菌酶基因局部（翻譯起始區前22位密碼子）和全局優化設計。利用mfold在線軟件對優化后的人溶菌酶基因序列進行RNA二級結構分析（http://unafold.rna.albany.edu/）。

采用Trizol 法提取人Hela細胞總RNA, 通過凝膠電泳和核酸定量檢測 RNA質量和濃度。根據Takara反轉錄試劑盒操作說明對RNA進行反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板，利用P-pGL3-cw引物（表 2）克隆獲得人溶菌酶編碼區序列（野生型溶菌酶序列，LYZcw）。反應條件為：98 ℃，30 s模板變性；98℃，5 s；57℃，15 s；72℃，15 s，30個循環。72℃，5 min延伸。以LYZcw cDNA為模板，利用P-pGL3-op22引物（表2）克隆獲得翻譯起始區密碼子優化序列（LYZop22），PCR反應條件同上。對上述獲得的LYZcw、LYZop22PCR產物經過膠回收純化、序列末端加A反應、T-A克隆并DH5α轉化后進行測序驗證（LYZcw-T、LYZop22-T）。全局密碼子優化的溶菌酶序列（LYZop），經生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成并克隆到 T載體中（LYZop-T）。

表2 LYZcw、LYZop22、LYZop序列克隆引物信息及基因合成Table 2 Primers for the amplication of LYZcw, LYZop22 and LYZop

1.4 pGL3-LYZcw/op22/op溶菌酶-熒光素酶融合表達構建

以Invitrogen公司pGL3-control載體為骨架載體，構建人溶菌酶基因與螢火蟲熒光素酶基因融合表達載體。通過NcoI內切酶分別酶切LYZcw-T、LYZop22-T、LYZop- T和pGL3-control載體。1%瓊脂糖凝膠電泳回收LYZcw、LYZop22、LYZop溶菌酶基因序列和線性化的pGL3-control載體。通過T4 DNA連接酶進行連接，分別構建pGL3-LYZcw/op22/op熒光素酶融合表達載體。測序篩選鑒定LYZcw/op22/op序列以正向插入并與螢火蟲熒光素酶基因正確融合的質粒用于下一步研究。

1.5 細胞轉染及熒光素酶檢測密碼子優化效果

分別將實驗室凍存的牛乳腺上皮細胞系（BMEC）、牛成纖維細胞（BFFC）及C127小鼠乳腺上皮細胞系復蘇，用完全培養基（DMEM高糖+10% FBS +1% PS）重懸，接種到T75培養瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。待細胞匯合度達到 90%時進行傳代接種于24孔培養板中（2×105/孔）。接種后的第二天，按照每孔 0.8 μg質粒（PGL-LYZcw/LYZop/LYZop22∶pRL-tk = 10∶1）：2 μLlipo3000比例轉染上述細胞，每組4個復孔，轉染48 h后通過熒光素酶活性檢測比較人溶菌酶密碼子優化效果。

1.6 pcDNA3.1-LYZcw/op22/op溶菌酶過表達載體構建

分別以pGL3-LYZcw/op22/op質粒為模板，利用P-pcDNA-cw、P-pcDNA-op22、P-pcDNA-op引物（表2）克隆LYZcw、LYZop22、LYZop序列（PCR反應條件參照1.3）并連接到T載體。使用HindIII、XhoI內切酶分別酶切pcDNA3.1（+）、LYZcw-T、LYZop22-T vector、LYZop- T，連接構建 pcDNA-LYZcw/op22/op人溶菌酶過表達載體，測序做進一步鑒定。

1.7 細胞轉染及實時熒光定量 PCR檢測密碼子優化效果

將培養的牛成纖維細胞（BFFC）、牛乳腺上皮細胞（BMEC）及C127細胞傳代接種于12孔培養板中（2×105/孔）。接種后的第二天，按照lipo3000轉染試劑說明書，每孔 1.6 μg質粒（pcDNA 空載、pcDNA-LYZcw/op22/op）：4 μL lipo3000 比例轉染上述細胞，每組4個復孔。24 h后按照1.3中方法提取細胞總 RNA并反轉錄獲得 cDNA，用于下一步定量PCR檢測。

對不同密碼子優化方式對重組人溶菌酶 mRNA水平表達量進行定量分析。反應條件為：預變性95 ℃，30 s。95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 個循環。循環結束后進行熔解曲線分析，確保擴增條帶單一。

1.8 Western-blot檢測密碼子優化效果

將培養的牛乳腺細胞（BMEC）經胰酶消化后接種于6孔培養板中（4×105/ 孔）。接種后的第二天，按照 lipo3000轉染試劑說明書，每孔 4.0 μg質粒（pcDNA 空載、pcDNA-LYZcw/op22/op）：10 μL lipo3000比例轉染上述細胞，每組4個復孔。轉染48 h后，收集蛋白用于Western-blot檢測。蛋白電泳采用分離膠濃度為12%，蛋白上樣量40 μg。電泳條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V，待溴酚藍跑出膠后終止電泳。蛋白轉膜按照伯樂半干轉膜儀操作說明，200 mA, 1h進行轉膜。轉膜結束后，PVDF膜經5%脫脂奶粉封閉——一抗4 ℃孵育過夜（人溶菌酶、GAPDH 1∶1 000稀釋）——TBST洗滌（3次，每次10 min）——二抗室溫孵育2 h（1∶3 000稀釋）——TBST洗滌（3次，每次10 min）——顯影——ChemiDoc XRS+儀器成像。

1.9 數據分析

采用2-△△Ct方法對real-time qPCR 分析計算目的基因相對表達量。GraphPad Prism 6.0進行 One-way ANOVA分析和作圖。數據均以平均數±標準誤（Mean±SEM）表示。

2 結果

2.1 牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子組成分析

通過CodonW軟件對牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子組成進行分析，結果表明，牛乳蛋白基因密碼子 GC含量平均為 0.485 ± 0.026，第三位堿基GC3s含量平均為0.537 ± 0.062。人溶菌酶基因密碼子GC含量為0.473，第三位堿基GC3s含量為0.407。上述結果表明，人溶菌酶基因整體 GC含量與牛乳蛋白基因GC含量相近，但第三位堿基GC含量低于牛乳蛋白基因 GC含量。牛乳蛋白基因密碼子偏好以 GC結尾，而人溶菌酶基因密碼子偏好以 AT結尾（表3）。

ENc值范圍為20（每個氨基酸只使用一個密碼子）到61（各個密碼子被均衡使用），其值越低，偏好性越強。牛乳蛋白及人溶菌酶ENc值分別為49.814和50.27，表明牛乳蛋白和人溶菌酶基因密碼子使用相對較平均。ENC vs GC3s線性回歸分析結果表明，7種乳蛋白基因有效密碼子數 ENc值與第三位堿基GC3s呈顯著負相關（R= - 0.8968，P＜0.01）（圖1），表明密碼子使用偏好性越強（ENc值越?。┑幕颍銰C3s值越高，主要偏好以GC堿基結尾的密碼子。因此，牛乳蛋白基因密碼子的使用偏好性受GC3s影響。

2.2 牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性分析

對編碼氨基酸且為簡并密碼子的7種牛乳蛋白基因使用的共59個密碼子（不含Met、Trp及3個終止密碼子）進行同義密碼子的相對使用度（RSCU）分析。結果表明，牛乳蛋白基因對CTG（2.71）、AGG（2.32）、GCC（1.73）、GTG（1.68）、ATC（1.64）等5個密碼子具有明顯的偏好性（RSCU＞1.5），為高頻密碼子。而 TTA（0.12）、ATA（0.18）、TCG（0.19）、CTA（0.25）、CCG（0.26）、GCG（0.45）、ACG（0.48）等7個密碼子在牛乳蛋白基因中使用較?。≧SCU＜0.5），為低頻密碼子（表4）。

表4 牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性分析Table 4 Codon preference analysis of bovine milk protein genes

圖1 牛乳蛋白基因ENc vs GC3s相關性分析Fig. 1 Correlation analysis of ENc vs GC3s of bovine milk protein genes

2.3 基因密碼子偏好性的聚類分析

以密碼子的RSCU 值作為變量，對具有簡并性的59個編碼氨基酸的密碼子進行聚類分析。依據RSCU值可以將7種牛乳蛋白較好的分成為兩大類：酪蛋白類（CSN2、CSN1S2、CSN3和CSN1S1）和乳清蛋白類（LTF、LGB和 LALBA），而人溶菌酶基因密碼子使用偏好與牛乳酪蛋白類更接近（圖 2）。結果表明，即使在同一乳腺組織內，編碼牛乳酪蛋白類基因密碼子和乳清蛋白類基因密碼子在使用偏好性上可能也存在一定差異。

2.4 人溶菌酶基因密碼子優化及分析

根據表3結果中牛乳蛋白基因高頻密碼子及低頻密碼子使用情況，對人溶菌酶密碼子進行了優化。其中LYZop對溶菌酶全局密碼子進行了優化，而 LYZop22只對翻譯起始區前22位密碼子進行了優化（表5）。

表5 人溶菌酶基因密碼子優化情況Table 5 Codon Optimization of human lysozyme gene

圖2 牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子使用RSCU值聚類分析Fig. 2 Clustering analysis of bovine milk protein and human lysozyme genes based on RSCU value

CodonW比較優化前后序列，結果表明，LYZcw、LYZop22、LYZop第三位堿基即 GC3s含量分別為0.407、0.450、0.757。mRNA二級結構最小自由能MFE從-138.83 kcal/mol（LYZcw）分別降低到了-141.02 kcal/mol（LYZop22）和-178.12 kcal/mol（LYZop），mRNA二級結構穩定性明顯提高。對mRNA翻譯起始區100個堿基進行二級結構分析，發現相比于LYZcw（-29.7 kcal/mol），LYZop22（-26.4 kcal/mol）和 LYZop（-31.0 kcal/mol）密碼子優化并沒有明顯改變翻譯起始區二級結構最小自由能，相反在5′端引入了更多的莖環結構（圖3），有利于核糖體與mRNA的結合并啟動翻譯。

圖3 人溶菌酶密碼子優化翻譯起始區（1-100 bp）mRNA二級結構示意圖Fig. 3 Schematic diagram of RNA second structure of codon optimized human lysozyme gene (1-100bp)

2.5 人溶菌酶-熒光素融合載體構建及溶菌酶表達分析

電泳和測序結果表明，成功克隆到了人溶菌酶野生型LYZcw、翻譯起始區密碼子優化的LYZop22 CDS區序列及全基因合成的全局密碼子優化的 LYZop CDS區序列，且與預期序列信息一致（圖4）。Nco1酶切和測序結果表明，成功構建了 pGL3-LYZcw/op22/op 3個人溶菌酶-熒光素酶融合表達載體，且LYZcw、LYZop22、LYZop編碼區與螢火蟲熒光素酶基因正確融合，沒有移碼突變（圖5）。

圖4 LYZcw、LYZop22和LYZop電泳檢測Fig. 4 LYZcw, LYZop22 and LYZop electrophoresis detection

圖5 pGL3-LYZcw/op22/op載體Nco1酶切鑒定Fig. 5 pGL3-LYZcw/op22/op vector identified by Nco1 enzyme digestion

通過lipo3000 將pGL-LYZcw+pRL-tk、pGL-LYZop+ pRL-tk、pGL-LYZop22 + pRL-tk分別轉染BMEC、BFFC、C127細胞，48 h后檢測熒光素酶表達量。熒光素酶檢測結果表明，相比LYZcw，全局密碼子優化的LYZop在BMEC和對照BFFC、C127細胞中分別提高了2.20倍（P＜0.01）、2.44倍（P＜0.01）和1.99倍（P＜0.01）。翻譯起始區密碼子優化的 LYZop22在BMEC細胞中相比野生型提高了1.48倍（P＜0.01），而在對照BFFC、C127細胞中差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

2.6 mRNA、蛋白水平檢測人溶菌酶基因密碼子優化效果

構建 pcDNA-LYZcw/op22/op過表達載體，并分別轉染BMEC、BFFC和C127細胞，檢測密碼子優化對人溶菌酶mRNA表達量的影響。實時熒光定量PCR結果表明，LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC細胞中分別提高了2.08倍（P＜0.05）和1.5倍（P＞0.05）。而LYZop相比野生型LYZcw在上述兩個細胞中分別提高了17.8倍（P＜0.01）和22倍（P＜0.01）（圖 7）。上述結果表明，根據牛乳腺主要蛋白進行密碼子優化后的溶菌酶能顯著提高其在牛乳腺上皮細胞和成纖維細胞轉錄水平表達量。

進一步對 pcDNA-LYZcw/op22/op過表達載體轉染的牛BMEC細胞進行人溶菌酶蛋白表達檢測。相比野生型LYZcw，密碼子優化的LYZop、LYZop22明顯提高了人溶菌酶在牛BMEC細胞中的表達量，且全局密碼子優化的 LYZop溶菌酶表達量高于翻譯起始區密碼子優化的LYZop22（圖8-A）。上述結果表明，密碼子優化能明顯提高人溶菌酶在牛乳腺上皮細胞中的表達。然而，經全局密碼子優化的人溶菌酶基因在牛乳腺上皮細胞中蛋白表達水平提高倍數低于mRNA水平提高倍數（圖8-B）。

圖6 熒光素酶檢測人溶菌酶基因密碼子優化效果Fig. 6 The effect of codon optimization analysis of human lysozyme gene by luciferase

圖7 mRNA水平檢測人溶菌酶基因密碼子優化效果Fig. 7 The effect of codon optimization analysis on human mRNA level of human lysozyme gene

3 討論

人溶菌酶作為非特異性免疫因子，對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等均具有廣譜的抗菌作用，在體內發揮著殺菌消炎、免疫調節、改善胃腸道菌群的作用。同時，在畜牧、農產品、食品、醫療和化妝品輕工等行業也具有廣泛應用前景。利用現代基因工程和乳腺生物反應器生產重組人溶菌酶克服了傳統提取方法蛋白穩定性差、成本高的不足，但如何進一步提高重組蛋白的表達量并用于下一步工業化生產仍是乳腺生物反應器首要考慮的問題。

圖8 蛋白水平檢測密碼子優化對人溶菌酶表達量的影響Fig. 8 The effect of codon optimization analysis on protein level of human lysozyme

近年來研究發現，不同生物密碼子的選擇不僅對蛋白高水平表達發揮作用，同時對微量的調控蛋白表達也起到調節作用[13]，這一發現對于提高外源重組蛋白的表達和生產具有重要的指導意義。研究發現，同一物種，不同組織甚至同一組織內不同蛋白其密碼子使用偏好性均存在差異，正是這種差異可能進一步調節著蛋白的表達量[18]。本研究中根據牛乳中7種主要乳蛋白基因密碼子偏好性進行聚類分析發現，牛乳中酪蛋白類（CSN2、CSN1S2、CSN3和CSN1S1）和乳清蛋白類（LTF、LGB和 LALBA）可以明顯的分為兩類。表明，同一組織內牛乳酪蛋白和乳清蛋白基因密碼子使用偏好存在一定的差異，而這種密碼子使用偏好性可能在一定程度上影響著牛乳酪蛋白和乳清蛋白表達量。密碼子使用偏好性分析發現，牛乳蛋白基因中發現5個高頻密碼子和7個低頻密碼子，且牛乳蛋白基因密碼子第三位堿基偏好以GC結尾，而人溶菌酶偏好以AT結尾。而較高的GC含量，特別是簡并堿基GC含量在哺乳動物細胞中與mRNA豐度和蛋白表達量呈正相關[19-20]。表明，人溶菌酶密碼子使用偏好性不利于在牛乳中高效表達，這也可能是造成牛乳腺生物反應器中重組人溶菌酶表達量低的主要原因[17, 21]。

密碼子使用偏好性在調節mRNA穩定性、蛋白翻譯起始、延伸等方面發揮了重要的作用[22-23]。本研究中局部和全局密碼子優化后的人溶菌酶 mRNA二級結構自由能 MFE分別由-138.83 kcal/mol降低到了-141.02 kcal/mol和-178.12 kcal/mol。前人研究發現，mRNA折疊強度與 mRNA豐度和蛋白表達量呈正相關[24-25]。本研究發現，隨著密碼子優化后人溶菌酶mRNA二級結構穩定性的增加，其mRNA表達量也相應提高。在牛BMEC等3種細胞中，全局密碼子優化的人溶菌酶 mRNA水平顯著高于局部密碼子優化的人溶菌酶，這一結果也與優化后 mRNA 穩定性呈正相關。表明，密碼子優化可能通過增加mRNA二級結構穩定性和 mRNA轉錄效率進而提高了人溶菌酶mRNA表達水平。

研究發現，mRNA 二級結構5′端的莖環結構有利于蛋白翻譯起始和延伸，進而提高蛋白表達量[26-27]。密碼子優化后的溶菌酶盡管整體mRNA MFE明顯降低，但進一步對 5′端翻譯起始后 100 bp mRNA堿基進行二級結構分析發現，密碼子優化并沒有明顯改變人溶菌酶基因前100bp 二級結構自由能，反而在翻譯起始區引入了更多的莖環結構，而5′端莖環結構的引入，有利于提高蛋白翻譯起始效率[28]。釀酒酵母中研究發現，蛋白表達豐度與 mRNA折疊強度存在正相關，而有效的 mRNA翻譯起始效率和較高的 mRNA二級結構縮短了核糖體之間的距離，使 mRNA的翻譯效率提高，進而提高了蛋白的表達豐度[25,29]。本研究中也發現，翻譯區密碼子優化后牛 BMEC和 BFFC細胞中人溶菌酶基因mRNA水平和蛋白水平相比野生型都有一定程度的提高。全局密碼子優化的人溶菌酶基因，在mRNA翻譯起始區引入了更多的莖環結構，同時，mRNA整體折疊也更穩定。因此，密碼子優化后的人溶菌酶表達量在 mRNA 水平和蛋白水平相比野生型均得到明顯的提高。

密碼子優化是提高外源重組蛋白表達的重要途徑之一。盡管目前已開發許多軟件可根據宿主密碼子使用偏好對目的基因密碼子進行優化和設計，然而關于密碼子優化的“金標準”仍未統一，密碼子優化的效果也不盡如人意，歸根結底是由于目前關于密碼子優化是如何影響外源蛋白表達仍存在很大的爭議。密碼子優化在mRNA轉錄效率[30]、穩定性[31]，蛋白翻譯起始[32]、延伸效率、蛋白折疊及蛋白穩定性[33]等多個環節均發揮了調節作用。ZHOU等研究發現，密碼子優化提高了目的基因蛋白和RNA表達水平，但主要是體現在mRNA轉錄水平的提高[30]。PRESNYAK 等[31]認為，密碼子優化是決定 mRNA穩定性的主要因素。本研究中發現，經全局密碼子優化的人溶菌酶基因mRNA二級結構穩定性得到明顯提高，其在牛乳腺上皮細胞中轉錄水平提高了17.8倍，然而其蛋白水平提高倍數卻低于mRNA水平提高倍數。表明，密碼子優化大幅提高了重組人溶菌酶mRNA的表達水平，但mRNA表達水平與蛋白表達水平并不一定呈強相關[34]，而mRNA轉錄后的修飾可能進一步影響了蛋白的表達。因此，通過密碼子優化提高mRNA表達水平的同時如何進一步提高蛋白表達水平及其內在分子機制仍有待于進一步研究。

4 結論

本研究通過生物信息學分析了牛乳腺主要乳蛋白基因密碼子使用偏好，獲得了牛乳蛋白基因密碼子使用偏好及使用的高低頻密碼子；依據牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性對人溶菌酶全局密碼子優化能顯著提高重組人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表達量，為今后利用生物反應器高效生產重組人溶菌酶奠定基礎。