農桿菌介導大麥無篩選標記轉基因植株的獲得

龔強，王軻，葉興國，杜麗璞，徐延浩

（1長江大學農學院，湖北荊州 434025；2中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081）

0 引言

【研究意義】大麥（Hordeum vulgareL.）是世界第四大禾谷類作物，約占禾谷類作物總產量的8%[1]。大麥營養成分豐富，富含蛋白質、抗性淀粉、纖維素和維生素等，而且大麥抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿性能較強，適應性廣，在應對惡劣環境化和土壤鹽漬化等逆境脅迫方面有著重要意義。目前，國內外大麥轉基因研究大多以轉化效率較高的品種Golden Promise為受體，利用其他商業化大麥進行轉化難以獲得轉基因植株，或者轉化效率很低，限制了大麥基因工程育種的步伐。近幾年，大麥高質量參考基因組序列和部分基因功能注釋不斷完善[2]，需要對大麥進行功能基因組研究。另外，國內還未發現有關無篩選標記轉基因大麥研究的報道。因此，提高大麥的遺傳轉化效率，拓寬大麥遺傳轉化的基因型，建立大麥無篩選標記遺傳轉化體系，對于大麥基因工程改良和產業化種植具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】長期以來，有關大麥遺傳轉化的研究較少，轉化效率較低。1994年 WAN等[3]利用基因槍分別轉化大麥 Golden Promise幼胚、愈傷組織和小孢子，首次獲得可育轉基因株系。TINGAY等[4]利用農桿菌介導法建立了大麥Golden Promise幼胚的轉化體系，轉化效率 4.2%。TRIFONOVA等[5]通過調整生長調節劑的種類、預培養時間和微損傷等方法，獲得大麥轉基因植株，轉化效率1.7%—6.3%。FANG等[6]將綠色熒光蛋白作為可視標記，以hpt作為篩選基因，利用農桿菌介導轉化大麥Golden Promise幼胚，轉化效率3.4%。TRAVELLA等[7]依據熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測結果，比較了農桿菌介導和基因槍介導對大麥轉化效率和轉基因拷貝數等的影響，發現農桿菌介導的轉化效率是基因槍的2倍，且在利用農桿菌介導獲得的轉基因植株中目標基因表達穩定、沉默情況較少。BARTLETT等[8]對農桿菌轉化大麥后的再生過程進行了進一步優化，將hpt標記基因和luc熒光素報告基因轉化大麥Golden Promise幼胚，轉化效率提高到25%。HENSEL等[9]進一步研究了外植體不同處理方法和共培養條件等因素對大麥轉化效率的影響，進一步提高了大麥Golden Promise幼胚的轉化效率（高達 86.0%），商業化春性大麥品種Optic、Helium和冬性大麥品種Igri、Tafeno等的轉化效率也達到0.2%—7.8%。目前，國內有關大麥遺傳轉化的研究非常少，還處在建立高頻再生體系和提高遺傳轉化效率的研究階段[10-20]。國內最早獲得大麥轉基因植株的研究報道出現于 2004年，任江萍等[21]以啤酒大麥品種晉引6號幼胚為材料，用基因槍法對1 200個幼胚進行了轟擊，獲得了7株陽性植株，轉化效率為0.58%，在過表達TrxS的轉基因植株中，α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性有顯著性提高[22]。呂維濤等[23]通過農桿菌介導法將反義磷脂酶Dγ轉入大麥，獲得了可耐0.7% NaCl的植株。李靜雯等[24]利用RNAi抑制B-hordein的合成，降低了大麥品種Golden Promise籽粒蛋白質的含量。隨著轉基因技術的發展, 轉基因植物的安全性已經引起了公眾的廣泛關注，其中篩選標記基因的存在是轉基因植物安全性評價的主要隱患。人們先后提出了幾種獲得無篩選標記轉基因植物的技術，包括共轉化法、定位重組體系、多元自動轉化載體系統、轉座子再定位系統和同源重組體系等，其中共轉化法應用最為普遍[25-26]。特別是農桿菌介導的雙 T-DNA載體共轉化法，不但可以避免將細菌篩選標記轉入植物，而且可以從轉基因植物中排除nptII、Bar、hpt等篩選標記，在獲得安全型轉基因植物方面具有獨特優勢[26]。農桿菌介導的共轉化系統已經在很多植物如煙草[27]、大豆[28]、玉米[29]、高粱[30]、水稻[31]和小麥[26]中成功獲得無篩選標記的轉基因植株。【本研究切入點】雖然大麥Golden Promise的遺傳轉化效率較高，但是其他大麥品種轉化效率仍然很低，需要拓展大麥基因型范圍和提高轉化效率。轉基因大麥安全問題無疑會受到關注，在國內建立大麥無篩選標記轉基因系統迫在眉睫?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬以優良大麥品種Vlamingh為受體，通過對培養基成分及培養步驟進行優化，建立其高效遺傳轉化體系。進一步利用農桿菌介導的共轉化法將雙T-DNA表達載體導入大麥，并通過后代自然分離獲得無篩選標記轉基因大麥植株。本研究將拓寬大麥轉基因的受體基因型范圍，為大麥基因功能解析和轉基因育種提供高效的轉化體系，為安全型轉基因大麥材料創制提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 植物材料和表達載體

供試材料為澳大利亞主栽大麥品種Vlamingh，播種于中國農業科學院作物科學研究所人工氣候室，生長期間的溫度為25℃，光周期為16 h光照、8 h黑暗。取授粉后 12—14 d 的幼胚用于遺傳轉化。T0代轉基因大麥植株及時移栽，放置于人工氣候室中生長和檢測。T1代轉基因大麥植株2018年9月種植于中國農業科學院試作物科學研究所溫室，用于篩選無篩選標記轉基因植株。

植物表達載體 pWMB123由葉興國實驗室構建[26]，包含2段獨立的T-DNA區域，一段T-DNA區域含有Bar，另一段T-DNA區域含有GUS（圖1）。將表達載體pWMB123轉入農桿菌菌株C58C1后用于大麥轉化。

圖1 雙T-DNA表達載體pWMB123結構Fig. 1 The structure of pWMB123 vector with double T-DNA regions

1.2 培養基

大麥遺傳轉化所用的基本培養基為 MS，在 MS培養基中添加不同有機物質（表 1），所有培養基的pH調整為5.8，121℃滅菌15 min。

將大麥幼胚誘導的愈傷組織分為3份，1份轉移到過渡培養基（transition medium，TM），另外2份分別轉移到分化培養基（differentiation medium，DM）和改良的分化培養基（modified differentiation medium，DMM：DM 培養基添加 kinetin（KT）1 mg·L-1、6-benzylaminopurine（6-BA）0.5 mg·L-1和 1-naphthaleneacetic acid（NAA）0.05 mg·L-1），光照培養2周，誘導綠芽分化。

將完整的大麥幼胚接種到1/2MS培養基上，進行成苗培養，利用該方法探索吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、吲哚丁酸（indole butyric acid，IBA）和萘乙酸（NAA）不同配比對大麥植株生根的影響。共利用 15種不同生長素配比的培養基對大麥植株的生根效果進行比較（表 2）。此外，根據已發表的文獻[9,32]，探索添加IBA，且沒有其他生長素的第一次篩選培養基（first selection medium，SM1）、DM和大麥再生培養基（barley regeneration medium，BRM，NH4NO30.32 g·L-1、KNO33.64 g·L-1、KH2PO40.325 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.441 g·L-1、MgSO4·7 H2O 0.246 g·L-1、NaFeEDTA 27.53 mg·L-1、MnSO4·H2O 84 μg·L-1、H3BO331 μg·L-1、ZnSO4·7 H2O 72 μg·L-1、Na2MoO4·2H2O 1.2 μg·L-1、CuSO4·5 H2O 0.25 μg·L-1、CoCl2·6 H2O 0.24 μg·L-1、KI 1.7 μg·L-1、Vitamin B5 112 mg·L-1、6-BAP 0.225 mg·L-1、L-glutamine 146.4 mg·L-1、36 g·L-1maltose stock, and 196 μL·L-1和 CuSO4·5 H2O 0.245 mg·L-1）的生根效果。

表1 農桿菌介導轉化大麥幼胚所用培養基及其組成Table 1 Composition of the media used for Agrobacterium-mediated barley immature embryo transformation (g·L-1)

表2 不同激素配比的15種1/2MS生根培養基Table 2 Composition of 15 rooting media with different hormone ratios on the basis of 1/2 MS medium (mg·L-1)

1.3 農桿菌介導轉化大麥幼胚

參考 BARTLETT等[8]方法進行農桿菌介導的大麥轉化，并進行較大改動，具體步驟如下：

1.3.1 取樣和滅菌 分批次種植大麥受體材料，取開花授粉后14 d左右的未成熟大麥籽粒，用70%乙醇表面滅菌 1 min，然后用 15%次氯酸鈉震蕩滅菌 15 min，最后用無菌水洗4—5次。在顯微鏡下用解剖刀掀開大麥種皮，用尖鑷子小心剝取大麥完整胚放置于沒有乙酰丁香酮的侵染液（infection medium，IM）培養基中。

1.3.2 農桿菌侵染和共培養 將攜帶表達載體pWMB123的C58C1農桿菌28℃過夜培養，取2 mL菌液5 000 r/min離心，然后加入2 mL IM培養基，侵染大麥幼胚約 10 min，然后將胚放入共培養培養基（co-culture medium，CM），23℃黑暗共培養。

1.3.3 愈傷組織的誘導 共培養2 d后，切除胚軸，盾片面向上轉移到SM1，進行愈傷的誘導和第一次篩選培養，25℃黑暗培養14 d左右，然后將愈傷組織轉移到SM2進行第二次篩選培養，25℃黑暗培養21 d左右。

1.3.4 愈傷組織的分化，轉基因苗的生根及移栽 將愈傷組織轉移到DM，25℃光照條件下培養2—3周，誘導綠芽分化。然后及時將綠芽轉到1/2MS生根培養基（rooting medium，RT）繼續25℃光照培養，根系健壯的再生小植株直接移栽到花盆中。

1.4 T0代轉基因植株的鑒定

從移栽成活的抗性再生植株上取少量葉片，利用Bar蛋白抗體試紙條法（取1 cm長的葉片，液氮速凍破碎；加入0.4 mL Extractin buffer，將試紙條標有指示箭頭的一端浸入 buffer內，靜止 1 min，觀察 Bar蛋白抗體表達結果）檢測Bar，利用組織化學染色法結合PCR擴增檢測GUS。

1.5 T1代中無篩選標記轉基因植株篩選

種植T0代Bar和GUS均為陽性的轉基因植株，利用新型植物基因組提取試劑盒 CW0531（康為世紀生物科技有限公司）從葉片中提取基因組DNA，然后分別用特異引物 Bar-F：5′-ACCATCGTCAACCACT ACATCG-3′，Bar-R：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTC ATG-3′和 GUS-F：5′-CAAGGAAATCCGCAACCATA TC-3′，GUS-R：5′-TCAAACGTCCGAATCTTCTCCC-3′對基因組中的Bar和GUS進行PCR檢測。PCR擴增體系為2×Taq Master Mix（諾唯贊生物科技有限公司，南京）7.5 μL、10 pmol·L-1引物各 0.5 μL 和 DNA模板50—200 ng，補充ddH2O至15 μL。反應程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 5 min。取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。統計 T1代轉基因植株中Bar和GUS的分離情況，篩選只含有GUS不含有Bar的無篩選標記轉基因植株。

1.6 Southern blot雜交

利用CTAB法從轉基因大麥葉片中提取高質量基因組 DNA，對 30 μg基因組 DNA用限制性內切酶EcoRⅠ進行過夜酶切，然后利用 1%的瓊脂糖凝膠在30 V電壓下電泳16 h。將凝膠置于20%鹽酸溶液中變性處理10 min，用ddH2O清洗2—3次。通過真空泵轉膜儀將酶切后的 DNA片段轉移至帶正電的尼龍膜上。以pWMB123質粒DNA為模板，分別用Bar和GUS特異引物（Bar-F、Bar-R、GUS-F和GUS-R）擴增的片段作為探針，探針標記和雜交過程參考 DIG High Prime DNA labelling and Detection Starter Kit II（Roche，美國）說明書進行。利用Tanon 5200化學發光成像系統顯影。

2 結果

2.1 不同培養基對大麥愈傷組織分化植株和生根的影響

將 SM2培養基上的大麥幼胚誘導的愈傷組織分為3份，1份按照BARTLETT等[8]方法轉移到TM上，在弱光照條件下（光照條件下用紙遮蓋培養皿）培養2周；另外2份分別轉移到DM和DMM上。大麥幼胚愈傷組織經在DM和DMM上正常光照培養2周后，發現DMM上大多數愈傷組織的能產生綠芽點或綠苗（圖2-A），而DM上僅有少數愈傷組織產生綠芽點（圖2-B），表明DMM比DM更適合大麥愈傷組織分化。將在TM弱光條件下繼代培養的愈傷組織轉移到 DMM 培養 2周后發現，雖然有綠芽的產生（圖2-C），但分化率明顯不及直接分化的愈傷組織。

將分化培養基上產生大麥再生小植株直接轉移到生根培養基1/2MS上，發現再生植株產生白化現象（圖3-A）。然后在培養基中添加2.5 mg·L-1的CuSO4，發現可以顯著降低白化現象（圖 3-B）。因此，后續所有使用的生根培養基都添加了2.5 mg·L-1的CuSO4，但是轉基因苗在1/2MS培養基上仍然不生根。

為了解決大麥轉基因植株生根困難的問題，首先利用一步成苗培養方法激素不同配比對大麥植株生根的影響。共利用15種不同生長素配比的培養基對大麥植株的生根效果進行了比較（表2），培養10 d后發現單加IBA的生根效果最好（圖4）。不同濃度的IBA都可以顯著促進大麥的生根，其中1 mg·L-1的生根效果最佳，因此，生根培養基中選擇添加到1 mg·L-1的IBA。

雖然一步成苗的大麥植株在添加 IBA的 1/2MS培養基上生根效果很好，但轉基因大麥植株在該培養基上生根效果并不理想。因此，又探索了添加IBA的沒有其他生長素的SM1、DM和BRM的生根效果。結果表明，大麥轉基因植株在僅添加IBA無其他生長素的DM和BRM雖然生長狀態不錯，但是仍然很難生根，而在添加IBA的無其他生長素的SM1的生根效果很好。

圖2 大麥愈傷組織在不同培養基上的分化情況Fig. 2 Differentiation performance of barley callus on different shoot induction medium

圖3 CuSO4對轉基因大麥小植株白化現象的影響Fig. 3 The effect of copper sulfate on the albinism of transgenic barley plants

2.2 大麥轉基因T0代陽性植株的獲得和檢測

利用攜帶pWMB123表達載體的C58C1農桿菌共轉化了大麥品種Vlamingh的138個幼胚，經過愈傷組織誘導和2次篩選培養，獲得了125個抗性愈傷組織，愈傷組織誘導率為91%。抗性愈傷組織經過在優化過的培養基上分化和生根，共獲得14棵候選轉基因植株（BL1—BL14），轉化效率為 10.14%。將幼苗及時移栽至花盆，在溫室中生長。然后對 T0代轉基因植株進行試紙條檢測，并提取基因組DNA進行目標基因的PCR檢測。Bar蛋白抗體試紙條檢測結果顯示全部轉基因植株中均含有Bar（圖6-A）；組織化學染色和PCR擴增結果顯示，其中4株轉基因株（BL2—BL5）不含有GUS（圖6-B和圖6-C），說明攜帶GUS和Bar的2個T-DNA的共轉化效率為71.43%。

2.3 T1代中無篩選標記轉基因大麥植株的獲得

為了獲得無篩選標記大麥轉基因植株，選取4個Bar和GUS均為陽性的T0代大麥轉基因植株BL1、BL6、BL7和BL8，形成T1代株系，研究T1代中外源轉入基因的分離情況。理論上，T1代應該分離出4種類型：Bar+GUS—、Bar—GUS+、Bar—GUS—和Bar+GUS+。利用PCR方法共檢測了98株T1代轉基因植株（圖7），在BL8株系獲得了2株無篩選標記（Bar—GUS+）植株（表3），共檢測到3株Bar+GUS—類型植株，沒有檢測到Bar—GUS—類型植株，其他植株全部為Bar+GUS+類型（表3）。根據PCR檢測結果，選取部分T1代轉基因植株，分別利用Bar和GUS作探針進行Southern blot鑒定（圖8），進一步證實BL8-15和BL8-19為無篩選標記的轉基因植株。在BL-8株系中無篩選標記植株的獲得效率為 6.9%，在全部 T1代植株中無篩選標記植株的獲得效率僅有 2.04%。以上結果也證實，Bar和GUS可以在大麥轉基因后代中穩定遺傳和表達。

表3 T1代株系中Bar和GUS的分離情況Table 3 Genotyping detection for the Bar and GUS genes in the selected T1 lines by PCR

圖4 大麥再生植株在不同激素配比培養基上的生根情況Fig. 4 Rooting status of transgenic barley plantlets on 15 media with different hormone ratios

圖5 不同培養基成分對大麥再生植株生根的影響Fig. 5 Effect of different media containing various auxin ratios on the rooting of transgenic barley plantlets

3 討論

3.1 大麥遺傳轉化體系優化

圖6 T0代轉基因大麥植株鑒定Fig. 6 Identification of T0 transgenic barley plants

圖7 T1代轉基因大麥株系BL8中Bar（A）和GUS（B）的PCR檢測Fig. 7 PCR detection of Bar (A) and GUS (B) genes in T1 transgenic barley plants

目前，國內外大麥遺傳轉化的受體品種主要為Golden Promise，基因型范圍非常窄。本研究利用了再生能力比較強的大麥品種Vlamingh，拓展了大麥遺傳轉化的范圍。尤其重要的是，該大麥品種為春性，在溫室條件下其生長周期比Golden Promise短一個月以上， Vlamingh作為受體材料不但可以縮短轉化周期，還可以減少在溫室培養材料的水電等消耗。本研究參考 BARTLETT等[8]描述的大麥遺傳轉化體系，并根據之前的文獻報道和葉興國實驗室在小麥遺傳轉化方面積累的經驗，對大麥遺傳轉化體系進行了優化。首先，發現同樣的大麥愈傷組織經過在TM上培養后分化能力下降（圖2），因此認為可以省略TM這一步驟，這樣不但縮短了大麥的遺傳轉化過程，也節省了時間和成本。另外，還對分化培養基進行了優化發現DMM分化效果最好（圖2）。通過調節生根培養基中不同激素比例（圖4）和培養基關鍵成分（圖5），篩選到了生根效果較好的 SM1。利用優化后的轉化體系植株再生率很高，但是由于改良分化培養基和生根培養基用了一些愈傷組織和再生植株，減少了器官齊全轉基因植株的數量，最終的轉化效率只有10.14%，該體系實際轉化效率應該更高。

圖8 T1代轉基因大麥植株的Southern blot鑒定Fig. 8 Southern blot detection of T1 transgenic barley plants

3.2 無篩選標記轉基因大麥植株獲得效率

WANG等[26]對農桿菌轉化雙 T-DNA載體的 12個小麥T1株系進行了無篩選標記轉基因植株篩選，在3個株系中獲得了無篩選標記轉基因植株，無篩選標記轉基因植株的獲得效率分別為 40.0%、14.3%和7.5%；而在全部T1代群體（共12個株系）中無篩選標記轉基因植株的獲得效率僅為4.3%。MATTHEWS等[33]利用農桿菌轉化雙T-DNA載體，也成功獲得了3個只含目標基因的無篩選標記轉基因大麥植株，無篩選標記轉基因植株獲得效率0.83%—18.55%。根據孟德爾遺傳定律，如果篩選標記基因和目標基因在 T0代轉基因植株中都以單拷貝形式存在，T1代中無篩選標記植株的獲得效率應為 18.75%，而本研究中 BL8株系T1代中無篩選標記轉基因植株的頻率僅為6.9%。本研究T1代大麥轉基因植株的Southern blot鑒定結果顯示（圖8），Bar和GUS在轉基因植株中整合的拷貝數較高，尤其Bar的拷貝數在多數轉基因植株中高達10個以上，顯著降低了無篩選標記轉基因植株的頻率。因此，為了提高無篩選標記轉基因植株獲得效率，需要降低轉基因植株中Bar整合的拷貝數。

MCCORMAC等[27]發現雙 T-DNA載體中 2個T-DNA區的大小影響外源轉入基因整合的拷貝數。WANG等[26]研究結果也表明，攜帶Bar的T-DNA區段較小導致其在轉基因植株中整合的拷貝數較多。在本研究中，含Bar的T-DNA區段長度僅為1.7 kb左右，而含GUS的T-DNA區段長度為4.4 kb，Southern結果也顯示GUS基因在轉基因植株中的拷貝數確實低于Bar。因此，增加含Bar的T-DNA區段長度可以降低Bar在T0代轉基因植株的拷貝數，從而達到增加T1代無篩選標記轉基因植株的獲得效率。

3.3 獲得無篩選標記轉基因植物的意義

目前，轉基因植物的生物安全性越來越引起了公眾關注，成為了轉基因植物商業化種植的主要限制。實際上選擇標記的存在是轉基因作物商業化的主要障礙之一。早期消除選擇標記和不必要的載體骨架將有助于克服生物安全性限制，并有助于環境釋放轉基因大麥。因此，開發無標記的轉基因大麥對于大麥轉基因育種和大麥轉基因商業化有重要意義。

在植物遺傳轉化研究中使用的標記基因主要有 2種類型：第一種是細菌選擇性標記，如bla、kan和aadA等；第二種是植物選擇標記，如nptII、Bar和hpt。盡管標記基因應用于遺傳轉化過程顯著提高了植物的轉化效率，但是由于大多數選擇標記編碼抗生素或除草劑的基因，獲得轉基因植株后這些基因在植物基因組中的存在和表達就變得多余。基因槍介導的共轉化可以去除植物選擇標記，但是由于細菌選擇標記與載體中的目標基因緊密連接，因此不能去除細菌選擇標記。基因槍轉化線性植物表達盒可以成功去除轉基因植物中的所有標記基因[34-35]。因此，無篩選標記轉基因植株通常利用基因槍介導或農桿菌介導的共轉化方法獲得。但是，無篩選標記轉基因植株的獲得效率與篩選標記基因整合的拷貝數密切相關，而一般情況下基因槍轉化產生的拷貝數顯著高于農桿菌轉化。所以，農桿菌介導的共轉化法是獲得無篩選標記轉基因植株的最優方法。

4 結論

本研究發現改良的DMM能顯著提高大麥愈傷組織的分化能力；添加1.0 mg·L-1的IBA的SM1（無其他生長素）的生根效果最佳；利用大麥品種Vlamingh建立了高效遺傳轉化體系且轉化效率可達10.14%，進一步利用雙T-DNA的表達載體在T1代中通過自然分離成功獲得了無篩選標記大麥轉基因植株。