血凝和血凝抑制試驗

陳美艷，羅福斌，任 芬

（1.新平縣動物疫病預防控制中心，云南新平 653400；2.新平縣畜牧站，云南新平 653400）

血凝、血凝抑制試驗是目前獸醫實驗室用于禽疫苗免疫抗體水平監測技術，也可用已知標準陽性血清（抗體）監測是否有該病毒（抗原）的存在。實驗室用血凝、血凝抑制試驗檢測雞血清中禽流感和新城疫抗體，其血凝反應（HA）可以理解為，禽流感病毒和新城疫病毒或其血凝素能和雞紅細胞發生凝集反應致使紅細胞不能自然沉降。血凝抑制反應（HI）理解為，當禽流感和新城疫工作抗原和血清樣品中抗體反應后，則紅細胞就不能再與工作抗原發生反應，這時紅細胞就呈現出自然沉降現象，當血清樣品抗體不足以和工作抗原反應時，工作抗原就和紅細胞發生凝集反應。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試劑

96孔U型微量反應板、移液槍及配套滴頭，禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H9亞型陽性血清、陰性血清、體積分數為1%雞紅細胞懸液、滅菌生理鹽水和加樣槽。

1.2 試驗方法

為避免出現紅細胞自凝現象，一般選用至少3只健康公雞分別采血，并清洗紅細胞后配制成體積分數為10%紅細胞懸液，最后配制成體積分數為1%紅細胞懸液。若1%雞紅細胞懸液用量大于100 mL時也可直接配制。一般按照等比例混勻體積分數為1%雞紅細胞懸液，如在試驗過程中遇到特殊情況，無法滿足等量比例混合時也可適當調整比例。整個試驗過程只能使用同1份雞紅細胞懸液，并保持混勻以確保紅細胞均勻；如有紅細胞破裂或者被污染情況，試驗無效。

1.2.2 血凝（HA）試驗，即抗原效價

按照中華人民共和國國家標準進行血凝試驗，根據熟練程度選擇平行測定抗原血凝效價，一般選擇3個平行測定，U型微量反應孔反應體系為0.075 mL混合液。使用抗原：禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原，批號：2018006，生產日期：20181228，有效期至20201227，生產廠家：哈爾濱維科生物技術有限公司。

1.2.3 4HAU抗原標定試驗

選用4單位抗原、2單位抗原、1單位抗原，1/2單位抗原、1/4單位抗原和1組生理鹽水對照進行標定。U型微量反應孔反應體系為0.05 mL混合液。

1.2.4 血凝抑制試驗（HI）

按照中華人民共和國國家標準進行血凝抑制試驗，U型微量反應孔反應體系為0.075 mL混合液。使用陽性血清名稱：禽流感病毒H9亞型陽性血清，批號：2018002，生產日期：20180906，有效期至20200907。生產廠家：哈爾濱維科生物技術有限公司。

2 結果與分析

2.1 抗原血凝（HA）試驗

室溫23 ℃下靜置40 min觀察結果。圖1、圖2為禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原血凝試驗結果。

以完全血凝（將反應板傾斜時紅細胞不滑落）的抗原最高稀釋倍數為一個血凝單位（HAU）為判定標準，該試驗對照孔上層清亮，紅細胞完全沉降，故將上述抗原血凝的終點滴度判定為1∶512，則4HAU工作抗原的稀釋倍數為1∶128。同時也配制稀釋倍數為1∶64 的工作抗原。

全內臟反位(Situs Inversus Viscerum)又稱“鏡面人”或“鏡像人”，是指人的心臟、 肝臟、脾臟、膽囊、腎臟、胃、腸等器官的解剖位置與正常人完全相反。此種病例極其罕見，最近本院脊柱外科收治1例“鏡面人”合并腰椎間盤突出癥病例，采用經Quadrant通道系統椎間孔腰椎椎間融合術(Mis-TLIF)治療，現將診治過程報道如下。

2.2 4HAU抗原標定試驗

將上述抗原血凝的終點滴度判定為1∶512，4HAU工作抗原的稀釋倍數為1∶128，即0.1 mL抗原懸液混入12.7 mL生理鹽水中充分混勻。

標定結果如圖3、圖4。4單位抗原、2單位抗原完全凝集，1單位抗原少于85%凝集，1/2單位抗原紅細胞流淌，判定工作抗原液中抗原稍微偏少，所測血清抗體滴度可能偏高。

將上述抗原血凝的終點滴度判定為1∶256，4HAU工作抗原的稀釋倍數為1∶64，即0.1 mL抗原懸液混入6.3 mL生理鹽水中充分混勻。

標定結果如圖5、圖6。4單位抗原、2單位抗原、1單位抗原完全凝集，1/2單位抗原約為60%凝集，判定工作抗原液中抗原稍微偏多，所測血清抗體滴度可能偏低。

將1∶128的工作抗原和1∶64的工作抗原進行1∶1（5 mL+5 mL）混勻標定結果如圖7、圖8。4單位抗原，2單位抗原，1單位抗原完全凝集，1/2單位抗原約為50%凝集，判定4HAU工作抗原液配制準確。

2.3 血凝抑制試驗（HI）

本次試驗所測陰性血清滴度小于1 log2，陽性血清滴度大于說明書1個滴度，試驗結果有效。圖9為本次試驗所測陰性血清滴度，圖10、圖11為所測陽性血清滴度。將反應板傾斜時3種4HAU工作抗原所測陽性血清都是第8孔和生理鹽水對照孔中紅細胞的流淌狀態一致。

3 結 論

3.1 抗原血凝的終點滴度判定以紅細胞不流淌為標準

所配制4HAU工作抗原標定時，1單位抗原孔中紅細胞沒有達到100%凝集。工作抗原液中抗原稍微偏少，其所測血清抗體滴度可能會偏高。

3.2 抗原血凝的終點滴度判定以紅細胞出現沉降為標準

所測抗原血凝效價為1∶512，所配制的4HAU工作抗原標定時，1/2單位抗原大于50%以上凝集，且1/4單位抗原孔中紅細胞流淌狀態沒有達到生理鹽水對照孔中紅細胞的流淌標準。判定工作抗原液中抗原稍微偏多，所測血清抗體滴度可能會偏低。

3.3 將兩種工作抗原懸液以1∶1比例混勻后標定

4HAU工作抗原液標定時完全符合工作抗原標定要求。

3.4 將3種工作抗原懸液用于測定禽流感病毒H9亞型陽性血清

其HI滴度完全一致并無差異。