宣威野生藥用植物滇龍膽倍性鑒定研究

張文平，劉小莉，顧慶黨

（1.宣威市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，云南宣威 655400；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500；3.宣威市利用外資辦公室，云南宣威 655400 ）

龍膽是常用中藥，有清熱燥濕，瀉肝膽火之功效，《中國(guó)藥典》1995年版一部規(guī)定為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或堅(jiān)龍膽的干燥根和根莖。前三種習(xí)慣稱“關(guān)龍膽”，后一種習(xí)慣稱“堅(jiān)龍膽”。堅(jiān)龍膽原植物即滇龍膽，為多年生草本，須根肉質(zhì)。主莖粗壯，有分枝。花枝多數(shù)叢生，紫色或黃綠色。花多數(shù)簇生枝端呈頭狀；花冠藍(lán)紫色或藍(lán)色，冠檐具多數(shù)深藍(lán)色斑點(diǎn)，漏斗形或鐘形。蒴果橢圓形或橢圓狀披針形。花果期8-12月。

染色體是遺傳物質(zhì)的載體。生物染色體的重組常常導(dǎo)致新種的出現(xiàn)，甚至進(jìn)化就是選擇壓力與染色體變化互相作用的結(jié)果，染色體在一定程度上能反映生物的本質(zhì)。倍性鑒定是倍性育種及其應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。染色體倍性的了解對(duì)于品種的鑒定、雜交組合的選配、雜交后代材料的提前篩選、親緣關(guān)系的鑒定等均具有十分重要的意義。目前未見滇龍膽的染色體研究報(bào)道。染色體計(jì)數(shù)法是目前確定植物染色體倍性最直接、最準(zhǔn)確的方法，一般分為取材、預(yù)處理、固定、解離、染色、制片、鏡檢和制作永久玻片等步驟。

1 材料與方法

1.1 供試材料

系《全國(guó)第四次中藥資源普查》宣威普查隊(duì)尤興良等于2020年2月17日取材于宣威市阿都鄉(xiāng)，經(jīng)云南省中醫(yī)大學(xué)劉小莉副教授鑒定為滇龍膽材料取回后于花盆栽植備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)參考陳達(dá)菊、楊青等人《三七根尖染色體倍性鑒定技術(shù)研究》的方法進(jìn)行。

1.2.1 取材部位

選用莖尖。

1.2.2 取材時(shí)間

分別于8:00、9:00、10:00、11:00、12:00取材，用相同的方法處理進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 預(yù)處理

采用5種方法預(yù)處理，各處理：

① 秋水仙堿處理1 h；

② 對(duì)二氯苯處理1 h；

③ 8-羥基喹啉處理1 h；

④ 秋水仙堿0.5 h+對(duì)二氯苯混合液處理0.5 h；

⑤ 水浸泡 1 h。

1.2.4 前低滲

吸掉預(yù)處理液，用蒸餾水洗1次，然后加蒸餾水浸1 h，使細(xì)胞膨脹，以利于染色體鋪展。

1.2.5 固定

用卡諾固定液（酒精∶乙酸＝3∶1）于常溫固定4～24 h。

1.2.6 解離

取出固定好的材料加1 mol/L的HCL,置60℃水浴解離5 min、10 min、15 min,水浴解離期間輕搖數(shù)次，以促使解離均勻。解離后于45%乙酸浸20 min軟化。

1.2.7 染色

卡寶品紅染色2～15 min。

1.2.8 壓片鏡檢

采用常規(guī)壓片法進(jìn)行壓制，顯微鏡下觀察滇龍膽染色體，并對(duì)染色體圖像拍照。

表1 不同采樣時(shí)間染色體分離效果比較

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖采樣時(shí)間對(duì)比（表1）

比較不同取材時(shí)間獲得中期分裂相細(xì)胞，分析分裂高峰。

由表1知，以10:00～11:00為最佳取材時(shí)間。

2.2 預(yù)處理方法對(duì)比（表2）

由于細(xì)胞分裂中期持續(xù)的時(shí)間很短，一般只有10～30 min，在正常情況下固定材料，中期分裂相較少，而且即便是處在分裂中期的細(xì)胞，由于染色體緊密排列在赤道板上，因此在制片過程中很難將染色體分散開，難以觀察計(jì)數(shù)，一般采用化學(xué)和物理方法對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理。

由表2知，以秋水仙堿處理0.5 h +對(duì)二氯苯處理0.5 h方法，效果最好。

2.3 解離時(shí)間對(duì)染色體的影響（表3）

解離的目的是使分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解細(xì)胞壁軟化或部分分解，使細(xì)胞和染色體容易分散壓平。本研究設(shè)計(jì)3個(gè)處理時(shí)間，分別為5 min、10 min、15 min。

由表3知，5 min處理時(shí)，莖尖分生區(qū)邊沿細(xì)胞分散，染色體不分散且模糊，解離效果差；10 min處理時(shí)，莖尖分生區(qū)整體細(xì)胞分散，染色體分散且清晰，解離效果最好；15 min處理時(shí)，大量的莖尖分生區(qū)細(xì)胞去壁后容易粘連堆集，不利于壓平鋪展，染色體出現(xiàn)碎片化游走或堆積，效果差。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 果

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生滇龍膽根系肉質(zhì)，不適宜水培。莖尖取材時(shí)，在室內(nèi)盆栽條件下10：00～11：00為最佳取材時(shí)間，先用秋水仙堿處理0.5 h后再用飽和對(duì)二氯苯處理0.5 h為最佳預(yù)處理方法，最佳解離時(shí)間為10 min。

3.2 討 論

通過大量的重復(fù)試驗(yàn)，探索出滇龍膽染色體制片的技術(shù)方法，確定宣威野生藥用植物滇龍膽的染色體條數(shù)為22條（見圖1），莖尖分生組織為正常的二倍體2n = 22。研究中，由于采集的野生樣本有限，加之栽培后長(zhǎng)勢(shì)不算均勻，染色體制片前取樣受溫度、環(huán)境和各生長(zhǎng)階段芽長(zhǎng)勢(shì)等多種因素的影響，大多時(shí)候制片得到的染色體均為軟染色體，給觀察分析帶來一些困難，具體原因有待進(jìn)一步探索。

表2 預(yù)處理方法比較

表3 解離時(shí)間研究對(duì)比

染色體倍性化在植物進(jìn)化、作物品種改良上作用重大，在遺傳育種、優(yōu)良農(nóng)藝性狀利用上還將發(fā)揮越來越重要的作用。準(zhǔn)確鑒定植物倍性水平是發(fā)揮其作用的重要環(huán)節(jié)。