低滲破紅法在非小細胞肺癌患者血性胸水中的應用

劉芳芳， 陳智偉， 祁曉育

血性胸水產生的病因多種多樣，而血性胸水的產生以惡性腫瘤多見[1]。常規的細胞塊技術常因紅細胞過多，掩蓋腫瘤細胞[2]，或者因腫瘤細胞豐度過低，使免疫組織化學、靶向治療相關位點的基因檢測無法進行，影響病理診斷和臨床治療。肺癌是臨床上最常見的腫瘤，現已居癌癥死亡原因的第一位，其中約85%為非小細胞肺癌(non-small-cell carcinoma，NSCLC)[3]。胸水樣本通常成為失去手術和穿刺指征或靶向治療后產生耐藥的NSCLC患者首選的檢測樣本。本實驗通過低滲破紅法制備腫瘤細胞富集的細胞蠟塊，探討低滲破紅法對NSCLC患者血性胸水中腫瘤細胞形態的影響及其在分子病理檢測前評估中的應用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本 收集2018年3月-2019年3月送檢的經免疫組織化學染色確診為NSCLC的血性胸水樣本24例，男性10例，女性14例，年齡(69.25±10.98)歲(53～90歲)。所有樣本均由病理科副主任醫師提供明確病理診斷與細胞形態判定。

1.1.2主要試劑 體積分數為10%的中性緩沖甲醛；蒸餾水；體積分數為50%的乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液(臨用前按1∶1混合)；DNA提取試劑盒(批號：12219082501X)、RNA提取試劑盒(批號：02218110501X)、人類EGFR基因突變檢測試劑盒(批號：11219081401X)、人類EML4-ALK融合基因檢測試劑盒(批號：01218081703X)、人類ROS1基因融合檢測試劑盒(批號：11219020201X)(廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)。

1.1.3主要儀器 臺式高速離心機(TG16-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；PCR儀(LightCycler 480，羅氏醫學儀器公司)；紫外分光光度計(SMA4000，Amoydx-Gimffe廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 根據前期對血性胸水不同的處理方法將實驗分為3組，即A組(常規組)，胸水樣本直接離心后取沉淀，懸浮固定制備成細胞塊；B組(混合液破紅組)，采用50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液破紅后[4]，懸浮固定制備成細胞塊；C組(低滲破紅組)，采用蒸餾水低滲破紅后，懸浮固定，制備成細胞塊。

1.2.2細胞塊的制備及H-E染色 收集血性胸水，靜置30 min，棄部分清澈的上清液，將剩余部分搖勻。用3支50 mL離心管分別取45 mL血性胸水，3 000 r/min離心5 min，棄上清。A組加入10%中性緩沖甲醛15 mL懸浮固定2 h；B組加入50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液45 mL；C組加入蒸餾水45 mL。B，C兩組在振蕩器中1 500 r/min充分混勻后，3 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入10%中性緩沖甲醛15 mL懸浮固定30 min。3組樣本均于3 000 r/min下離心5 min，棄上清，取出細胞團，棉紙包裹后脫水包埋制成細胞塊，切片厚度為4 μm，行H-E染色。

1.2.3核酸提取及相關基因檢測 取3種不同方法所獲得的細胞塊，各切取厚度為5 μm的石蠟卷5卷于1.5 mL的EP管中。加入1 mL二甲苯，1 500 r/min震蕩至石蠟完全溶解，12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 mL無水乙醇，1 500 r/min震蕩，12 000 r/min離心2 min，去除殘余二甲苯，棄上清。按照石蠟組織標本DNA和RNA提取試劑盒說明書提取細胞塊基因組DNA和RNA。紫外分光光度計檢測DNA及RNA的濃度和質量。對C組樣本采用ARMS-PCR法進行肺癌靶向治療相關的基因檢測，包括EGFR基因突變檢測、EML4-ALK融合基因檢測及ROS1融合基因檢測。按照說明書于Light-cycler 480 PCR儀上機檢驗。

1.2.4結果判斷 H-E染色結果由病理科副主任醫師顯微鏡鏡檢后，按照既定的評定標準進行判讀(表1)。對所獲取的DNA和RNA樣本通過紫外分光光度計檢測濃度和純度，濃度≥2 ng/μL、且DNR/RNA和蛋白質含量的比值(OD260/280)在1.8～2.1視為核酸樣本合格。基因突變檢測結果由兩名分子病理診斷醫師對PCR反應擴增曲線進行判讀。

表1 細胞塊石蠟切片H-E染色結果評價標準

1.3統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，χ2檢驗分析H-E染色結果評分差異和核酸質量合格率，P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1H-E染色 A組切片紅細胞含量多，腫瘤細胞豐度低、輪廓結構模糊，并且存在細胞重疊、掉片等情況(圖1A)；B，C組切片紅細胞含量低，腫瘤細胞豐度高，細胞結構輪廓清楚，背景清晰，較少出現細胞重疊、掉片情況(圖1B，C)。經統計學分析顯示，H-E染色評分A組與B組及C組比較，差別均具有統計學意義(P<0.05)，而B組與C組間差別則無統計學意義(P>0.05，表2)。

A：A組常規細胞塊技術制備的切片；B：B組50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液破紅后制備的切片；C：C組低滲破紅法破紅后制備的切片.圖1 細胞塊石蠟切片H-E染色結果( ×400)Fig 1 The results of H-E staining( ×400)

表2 細胞塊石蠟切片H-E染色評價結果

2.2核酸檢測結果 經紫外分光光度計檢測A，B，C 3組細胞塊所提取DNA濃度和純度(圖2)，所提取的DNA合格率分別為54.2%，95.8%和100%，C組明顯高于A組，兩者差別有統計學意義(P<0.05)，而B組與C組間差別則無統計學意義(P>0.05，表3)。

經紫外分光光度計檢測A，B，C 3組細胞塊所提取RNA濃度和純度(圖2)，所提取的RNA合格率分別為29.2%，75%和79.2%，C組明顯高于A組，差別有統計學意義(P<0.05)，而B組與C組間差別則無統計學意義(P>0.05，表3)。

2.3基因檢測結果 將C組所提取的核酸進行肺癌靶向治療相關的基因檢測，其中13例檢測到EGFR基因突變，11例為野生型。24例樣本均未檢測到EML4-ALK和ROS1融合基因(圖3)。所有檢測結果均符合廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司所提供相應試劑盒說明書判讀標準。實驗結果表明低滲破紅法細胞制備的細胞塊提取的基因組核酸合格率高，且適用于相應的肺癌靶向治療相關的基因檢測。

A1及A2：A組常規細胞塊技術所獲DNA和RNA；B1及B2：B組50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液破紅所獲DNA和RNA；C1及C2：C組低滲破紅法所獲DNA和RNA.圖2 核酸樣本DNA或RNA的濃度及質量檢測結果Fig 2 The detection results of DNA or RNA concentration and purity

A：EGFR基因突變檢測結果；B：EML4-ALK融合基因檢測結果；C：ROS1融合基因檢測結果.圖3 低滲破紅法所獲核酸ARMS-PCR檢測結果Fig 3 The results of ARMS-PCR

表3 不同方法獲得細胞塊所提取核酸合格率比較

3 討 論

近年來，肺癌的發病率和死亡率逐年增加，現已成為臨床最常見的死亡原因[5]，大部分患者就診時已是晚期[6]，其中，多數為NSCLC。隨著精準醫療概念的提出以及NSCLC驅動基因的靶向治療取得明顯的療效，基因突變的分子檢測成為NSCLC靶向治療的指向性指標[7]。驅動基因包括EGFR基因突變、ALK基因融合/重排、c-ROS-1融合/重排、c-MET基因突變、KRAS基因突變、BRAF基因突變及免疫治療指標PD-1和PD-L1等[8-9]。對于紅細胞富集的血性胸水直接離心收集脫落的腫瘤細胞，無論是直接取沉淀拉片或制備成細胞塊進行切片，均因紅細胞過多而掩蓋腫瘤細胞，造成腫瘤細胞檢出率低，導致相應靶向基因突變檢測無法進行，使這部分患者失去精準靶向治療的機會。然而破紅處理經常會對血性胸水中的腫瘤細胞造成一定的影響，如結構不夠清晰，細胞形態不夠清楚，給NSCLC的診斷造成困難。現已有文獻報道多種去紅細胞法，如氯化銨去紅細胞法、乙酸去紅細胞法等對胸水中的腫瘤細胞形態影響較小，但其對NSCLC患者血性胸水中腫瘤細胞分子檢測的影響尚未可知[10]。

低滲破紅法是通過不同細胞對滲透壓的滲透脆性不同達到分離細胞的目的，其關鍵技術是最大限度的破壞紅細胞而又最大程度保護目的細胞。低滲破紅法制備細胞塊操作簡便、經濟。根據本研究獲得的經驗，低滲破紅法的破紅時間過長或反復破紅甚至離心次數及離心速率亦會對腫瘤細胞造成損傷，在實驗過程中應減少破紅次數，縮短破紅時間，采用低速離心方法制備細胞塊。核酸的質量是驅動基因狀態檢測的基礎，需對制備的細胞塊切片進行H-E染色，顯微鏡下評估腫瘤細胞豐度與狀態。切取適當數量的細胞蠟卷，保證足夠數量的腫瘤細胞，達到肺癌靶向治療相關的基因檢測的要求。常規方法處理獲得的細胞塊紅細胞豐度較高，所提取的核酸濃度低、質量差，且血紅素為PCR反應的抑制物，常常使驅動基因狀態檢測出現假陰性結果甚至檢測失敗。低滲破紅法和50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液破紅所獲得的細胞塊紅細胞量明顯減少，核酸濃度和質量合格率明顯提高，增加了肺癌靶向基因檢測的成功率和可信度。50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液破紅法是目前常用的破紅方法，低滲破紅法與之相比較無明顯差異。

本研究結果表明，低滲破紅法去除NSCLC患者血性胸水中的紅細胞，使H-E切片染色背景清晰，紅細胞含量顯著降低，腫瘤細胞豐度明顯升高，細胞結構輪廓清楚，有效減少細胞重疊、掉片等情況，明顯提高腫瘤細胞的檢出率。肺癌驅動基因檢測13例為EGFR基因突變型，11例為野生型，突變率為54.2%。文獻報道在ⅢB和Ⅳ期的NSCLC組織學標本中，EGFR基因突變檢出率為51.4%[11]，ALK和ROS1基因突變的檢出率分別為4.65%和1.0%[12-13]，本研究結果與上述結果基本一致。綜上所述，低滲破紅法不僅是處理NSCLC患者血性胸水的有效方法，且該方法制備的細胞塊能夠支持肺癌靶向治療相關的基因檢測。