TNFAIP8在子癇前期胎盤組織中的甲基化情況及表達

林 靚， 柳之彥， 林 容， 阮輿鑫， 董潔瓊， 鄭 晶

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種妊娠期特發的可能導致多器官多系統損害的高血壓疾病，發病機制與早期胎盤形成缺陷有關。DNA甲基化是一種相對穩定的表觀遺傳修飾，為解釋胎盤基因的異常表達以及相關信號通路的變化機制提供了良好的切入點。腫瘤壞死因子誘導蛋白8(tumor necrosis factor α-inducing protein 8，TNFAIP8)是一種參與調節細胞增殖和分化的蛋白，在維持細胞穩態和調控自身免疫方面起著重要作用。本研究擬通過人類全基因組芯片篩選胎盤組織候選基因，探討PE發病機制的表觀遺傳背景，為子癇的防治和管理提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1對象 選取2016年3月—2017年8月在筆者醫院產科分娩的46例孕婦，其中早發型PE組(early-onset preeclampsia，EOPE)16例，晚發型PE組(late-onset preeclampsia，LOPE)12例，正常足月分娩孕婦組(normal pregnancy，NP)18例。PE診斷參考《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》的診斷標準，在妊娠34周前因PE終止妊娠者為PE。排除標準：(1)妊娠合并癥及并發癥：妊娠合并慢性高血壓病、糖尿病、腎病、免疫系統疾病、內分泌疾病及腫瘤等；(2)輔助生殖技術受孕；(3)畸胎或死胎；(4)多胎妊娠(≥2胎)；(5)嗜酒、吸毒及濫用藥物者。本研究經筆者醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血及胎盤組織采集 入院后抽取肘靜脈血液2管各3 mL，置于EDTA抗凝管中。胎盤娩出 15 min內從4個不同胎盤小葉取材，用無菌 PBS 緩沖液反復沖洗血污，直至沖洗液接近無色，將組織剪碎至1 mm3，置于凍存管液氮預處理，送-80 ℃冰箱保存。

1.2.2DNA及RNA抽提 采用DNA提取試劑盒(批號：No.59124，德國Qiagen公司)抽提樣本DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度(≥2 μg)。采用RNA提取試劑盒(Cat#CW0581，中國CWbio公司)提取樣本總RNA。

1.2.3Illumina Human 450K甲基化芯片檢測 從EOPE組、LOPE組、NP組中選取年齡及孕周相匹配的胎盤各3例，均為單胎自然受孕，孕次1～2次，產次0～1次，進行甲基化芯片檢測。

1.2.3.1實驗步驟 對提取的胎盤組織DNA進行亞硫酸氫鹽處理，針對每個甲基化位點同時設計兩種探針，進行芯片雜交、洗脫、延伸、成像，并對探針雜交及亞硫酸氫鹽轉化效率進行質控。

1.2.3.2數據分析 采用Illumina公司的Genome Studio軟件進行原始數據處理分析，包括差別性分析、DeltaBeta篩選及Diffscore篩選。以下為各衡量指標的計算公式：

(1)β值是衡量該位點甲基化程度的指標，該值區間(0，1)，越接近于1該位點甲基化程度越高，越接近于0該位點甲基化程度越低。Illumina甲基化平臺的計算公式為：

(2)M代表每個探針在IP DNA和input DNA中的相對富集程度，計算公式為：

M=lgβ

1.2.4焦磷酸測序驗證 根據候選基因位點序列信息，采用PyroMark Assay Design 2.0設計引物序列(表1)。每個樣本各取1～2 μg DNA，用EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit甲基化轉化試劑盒進行轉化，以轉化后的DNA樣本做模板進行PCR檢測。取15～20 μL PCR產物上PyroMark Q24實時定量焦磷酸系列分析儀，PyroQ-CpG軟件分析該位點甲基化狀態。

表1 焦磷酸測序引物名稱及序列

1.2.5RT-PCR檢測TNFAIP8-mRNA 取5 μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測RNA的完整性。采用DNaseⅠ試劑盒(Cat# CW2090，中國CWbio公司)對RNA中殘留的DNA進行消化處理，用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒(Cat#CW0744，中國CWbio公司)進行反轉錄，上ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測，用2-△△CT法進行數據相對定量分析。

表2 RT-PCR引物名稱及序列

1.2.6Western-blot檢測TNFAIP8蛋白 制備 SDS-PAGE膠，提取胎盤及血液蛋白，進行蛋白樣品變性電泳及凝膠轉膜，測定蛋白濃度，采用Image J軟件分析灰度值。

2 結 果

2.1臨床資料比較 3組患者的年齡、妊娠和分娩次數、孕早期BMI比較，差別無統計學意義(P>0.05)；與NP組比較，EOPE組及LOPE組的平均動脈壓和24 h尿蛋白定量升高，分娩孕齡和胎兒出生體質量降低，差別有統計學意義(P<0.05)。

表3 臨床資料比較

2.2胎盤組織整體及TNFAIP8位點的甲基化芯片檢測結果 胎盤組織TNFAIP8位點探針主要分布在5’UTR區，甲基化芯片共檢測485 577個位點。EOPE組、LOPE組和對照組的胎盤整體平均甲基化程度分別為0.47，0.46，0.46。3組的TNFAIP8甲基化程度和富集程度比較，差別有統計學意義(F=6.992，P=0.027；F=6.985，P=0.027)。與LOPE組、NP組比較，EOPE組的甲基化程度和富集程度顯著降低，差別有統計學意義(P<0.05)；而LOPE組與NP組比較，差別無統計學意義(P>0.05，表4)。

表4 3組胎盤芯片TNFAIP8甲基化水平差別

2.3焦磷酸測序驗證TNFAIP8位點甲基化水平

2.3.1焦磷酸測序峰圖 設計TNFAIP8的甲基化測序序列為YGGTAATYGTTTTTGTAGTTGGTTAT。測序峰圖中藍色矩形陰影上方對應的黃色方塊提示檢測效果穩定，所標數值是以百分率表示的該位點甲基化程度(圖1)。

圖1 TNFAIP8的焦磷酸測序峰圖Fig 1 Spectrum of TNFAIP8 pyrosequencing

2.3.23組的TNFAIP8甲基化程度及差別 3組TNFAIP8 基因的兩個位點平均甲基化程度見表5。3組的位點1甲基化程度比較，差別有統計學意義(F=6.361，P=0.004)；而位點2甲基化程度比較，差別無統計學意義(F=2.984，P=0.061)。EOPE組中出現多例TNFAIP8未甲基化，即甲基化程度為0。位點1中EOPE組4例(25%)未甲基化，LOPE組和NP組無此現象；位點2中EOPE組5例(31.25%)未甲基化，LOPE組1例(8.33%)，NP組1例(5.56%)。與NP組比較，EOPE組及LOPE組位點1甲基化程度顯著降低，差別有統計學意義(P<0.05)；而LOPE組和NP組比較，差別無統計學意義(P>0.05)。

表5 3組間TNFAIP8焦磷酸測序甲基化水平差別

2.4RT-PCR及Western-blot檢測胎盤及外周血TNFAIP8蛋白表達 3組胎盤組織的TNFAIP8-mRNA相對定量和蛋白表達比較，差別均有統計學意義(F=243.252，P=0.000；F=38.594，P=0.000)。外周血TNFAIP8-mRNA相對定量和蛋白表達比較，差別均有統計學意義(F=405.209，P=0.000；F=143.199，P=0.000，表6)。組間采用Turkey HSD檢驗比較，差別有統計學意義(P<0.05)。胎盤和外周血TNFAIP8蛋白電泳圖呈現按照EOPE→LOPE→NP順序表達逐漸下降的趨勢(圖2)。

表6 3組胎盤和外周血TNFAIP8表達及差別

TNFAIP8：腫瘤壞死因子誘導蛋白8； EOPE：早發型子癇前期；LOPE：晚發型子癇前期；NP：正常妊娠.圖2 胎盤組織和外周血TNFAIP8電泳條帶Fig 2 Electrophoretic bands of TNFAIP8 in the placenta and peripheral blood

3 討 論

PE是一種妊娠期特有的母親-胎兒-胎盤疾病，各種發病機制通路之間復雜的相互作用很大程度上阻礙了有效干預靶點的探尋。胎盤在以母體全身性炎癥、內皮損傷、高血壓和蛋白尿為特征的終末通路中起著關鍵作用[1]。新近研究不斷揭示表觀遺傳機制在PE發生發展中的作用，特別是DNA甲基化成為胎盤源性疾病研究的焦點所在。甲基化介導的轉錄失調基序(methylation-mediated transcriptional dysregulation motifs，methTDMs) 可能參與PE的發病機制[2]，因此,建立DNA甲基化與PE之間的關聯將為探索PE的臨床監測指標和藥物靶點提供科學依據。

本研究通過人類全基因組Illumina Human 450K甲基化芯片篩選異常甲基化候選基因并用焦磷酸測序驗證。雖然3組胎盤總體甲基化程度相近，但是本課題組前期研究顯示，特定基因的甲基化程度卻各有顯著性差別，并涉及免疫及生長發育的多條途徑[3]。同源盒基因在人類胎盤中廣泛表達，調控胚胎和胎盤發育，而且大多數同源盒基因在整個妊娠過程中都是低甲基化的[4]。本研究結果與此相似，PE尤其是EOPE胎盤組織中TNFAIP8基因顯著低甲基化甚至未甲基化。約70%的CpG島位于人類基因啟動子的5’端區域，大多數CpG島未甲基化，而未甲基化則代表基因具有潛在活性[5]。PE可分為EOPE和LOPE兩種亞型。EOPE主要與胎盤重塑、胎盤功能障礙有關；LOPE主要與代謝紊亂、肥胖、糖尿病、脂代謝紊亂和炎癥影響內皮功能有關[6]。本研究TNFAIP8的甲基化焦磷酸測序驗證結果也顯示，相對于LOPE和NP組，EOPE組胎盤的甲基化程度顯著降低；但是LOPE和NP組卻未顯示出差別，這可能與兩種亞型發病機制存在不同有關。既往認為兩者是同一種疾病的兩種階段，但是現在更多的研究結論傾向于兩者是機制截然不同的兩種疾病。

1997年，Patel等在人類頭頸鱗狀細胞癌株上首先發現并鑒定出TNFAIP8蛋白[7]，也稱為SCC-S2、GG2-1和NDED，它是一種和細胞凋亡密切相關的免疫調節蛋白。TNFAIP8包含一個假定的死亡效應域，可影響各種類型細胞的凋亡和自噬[8]。TNFAIP8的表達與前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、食道癌、卵巢癌、宮頸癌、胰腺癌等多種癌癥的發病機制密切相關[9]，且影響化療耐藥性及生存預后[10]。在胎盤形成早期，滋養細胞的行為極其類似于腫瘤細胞，具有形成血管、遷移、侵襲等功能。

有研究顯示，降低腫瘤細胞TNFAIP8的表達，將降低血管內皮生長因子受體VEGFR-2、基質金屬蛋白酶MMP-1及MMP-9的表達[11]。若用小干擾RNA沉默成纖維細胞上TNFAIP8的表達，MMP-1產生水平也明顯降低[12]。既往研究已證實，系列MMPs分子與PE發病相關，MMP-3與EOPE有關，而與LOPE無關；升高的MMP-2和MMP-13及降低的MMP-9均與早發及晚發型重度PE有關[13]。本研究中，PE尤其是EOPE胎盤組織中TNFAIP8-mRNA和蛋白的過表達導致系列MMPs分子異常表達，影響母胎界面血管床重塑障礙出現胎盤形成缺陷。另外，PE孕婦外周血管過表達MMPs受體，MMP可通過該受體發揮強大的收縮血管功能，準確模擬PE全身外周血管痙攣的病理特征；而MMPs介導的膠原蛋白不平衡性刺激溶膠原活性，也會造成血管壁通透性增加引起PE特有的癥狀水腫和蛋白尿[13]。因此，TNFAIP8作為MMPs分子導致PE發病的上游原因之一，可作為深入探索發病機制以及糾正血管和膠原蛋白功能的切入點，改善PE預后。

本研究還發現，與NP組比較，EOPE組和LOPE組的外周血中TNFAIP8蛋白表達差別也很顯著。Xiang等發現，正常孕婦外周血中TNFAIP8家族成員TIMP-3完全甲基化，而發生PE時胎盤中TIMP-3則明顯低甲基化或未甲基化[15]，由此，檢測母血中由胎盤釋放的異常甲基化TIPM-3濃度有望實現早期診斷和預測PE。本研究也證實了外周血TNFAIP8的表達水平能切實反映胎盤的病理性甲基化情況，后續研究將探討不同孕周孕婦外周血中TNFAIP8的甲基化情況，進一步驗證TNFAIP8作為診斷和預測的外周血生物學指標的可行性。

PE是妊娠期特有的嚴重影響母嬰預后的疾病之一，TNFAIP8在胎盤中的表達以及和PE是否存在關聯，目前研究還很有限。本課題組在后續已完成的胎盤組織miRNA測序研究中也發現了TNFAIP8的上游微調控開關，后續將把TNFAIP8作為關鍵蛋白，推測異常轉錄翻譯的信號通路，探索上游和下游的調控機制，豐富PE的發病理論，并驗證其作為預測指標的可行性，這對于完善PE的分子生物學機制具有重要的理論意義和潛在的應用價值。