miR-581在食管鱗癌中的表達及其對食管鱗癌K30細胞增殖、遷移與侵襲的影響

程 曄， 胡巧珍， 陳淑勤， 黃愛民

食管癌位居我國惡性腫瘤發病率的第6位、腫瘤死因的第4位[1]。食管癌中絕大部分類型為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，預后差，5 a生存率僅20%[2-3]。

microRNAs(miRNAs)是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA[4]。研究發現，miRNAs參與食管癌的增殖、凋亡、侵襲、轉移、耐藥等多個過程[5-7]，如miR-99b/let-7e/miR-125a這一miRNA簇能夠被ZEB1(E盒結合鋅指蛋白1)所誘導進而促進ESCC的侵襲和轉移[8]，miR-338-5p能靶向FERMT2抑制ESCC細胞的增殖、菌落形成、遷移和順鉑耐藥[7]。

miR-581是新近發現的miRNA。研究發現，miR-581在肝癌和結直腸癌中表達下調，過表達miR-581可抑制結直腸癌SW620細胞的侵襲和轉移[9-10]、抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。筆者擬檢測miR-581在食管癌組織中的表達情況及miR-581對ESCC K30細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為探討ESCC惡性進展的分子機制提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 選取2013年2月—2014年2月經手術治療的ESCC患者33例，手術中將切除的癌組織及其配對癌旁組織放置于液氮中保存。本研究獲取的組織標本經過醫院倫理審查委員會審批并取得患者知情同意。K30細胞(人ESCC細胞KYSE30)為本實驗室保存(中山大學附屬腫瘤醫院關新元教授惠贈)。miR-581 mimic轉染ESCC細胞K30作為實驗組，用陰性對照片段轉染K30作為陰性對照組(negatitive control，miR-581-NC組)。

1.2主要試劑及材料 DMEM細胞培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)，Transwell小室及Transwell鋪膠小室(美國BD公司)，CCK8試劑盒(美國MCE公司)，Lipofectamime2000(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(RR037A，日本TakaRa公司)，SYBR green 熒光染料(美國Bio-Rad公司)。miR-581-mimic及其NC組、miR-581引物及內參U6引物均購自廣州銳博生物科技公司。

1.3細胞培養及轉染 培養液為含10%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2恒溫培養箱中培養。將處于對數生長期的ESCC細胞接種于6孔板內，待細胞融合度為60%時，采用Lipofectamime2000進行轉染，6 h后更換含血清的正常培養基繼續培養或用于后續實驗。

1.4實時熒光定量PCR(qPCR)檢測組織及ESCC細胞中miR-581的表達 采用Trizol試劑提取組織或細胞中的總RNA，逆轉錄合成cDNA。擴增體系采用Universal SYBR Green Supermix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模版cDNA 1 μL，加無核酶水至10 μL。采用2-ΔΔCt法計算miR-581的相對表達量。

1.5CCK8檢測細胞的增殖能力 96孔板每孔加入密度為5×103mL-1的細胞懸液200 μL，設置 5個復孔。待細胞貼壁后，分別在0，24，48，72，96，120 h棄去待測孔的培養液，加入10 μL CCK-8及90 μL培養液，孵育2 h后酶標儀檢測OD450值，繪制細胞生長活力曲線。

1.6Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲能力 Transwell遷移實驗采用不鋪膠的小室，Transwell侵襲實驗采用預制膠包被的小室。Transwell上室中加入細胞密度為8×104mL-1的無血清細胞懸液200 μL，下室加500 μL含10%FBS的DMEM。接種12 h后收集Transwell小室，甲醇固定15 min、0.1%結晶紫染色20 min，1×PBS緩沖液洗滌3次，用棉簽擦掉上室內側未穿過小室的細胞，小室倒置于顯微鏡下，隨機選擇5個視野進行拍照計數。

1.7統計學處理 采用GraphPad Prism 6統計軟件處理，ESCC組織與相應的癌旁組織中miR-581的表達差別采用配對t檢驗，兩組間比較采用Student′st檢驗，P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1癌組織及癌旁組織中miR-581的表達結果 qPCR檢測33對ESCC和癌旁組織中miR-581的表達水平。結果顯示，ESCC組織中miR-581的表達水平低于相應的癌旁組織，差別有統計學意義(P<0.01，圖1)。

與癌旁組織比較，△△：P<0.01.圖1 q-PCR檢測食管鱗癌和癌旁組織中miR-581的表達情況Fig 1 The expression of miR-581 in ESCC and the adjacent normal tissues was detected by q-PCR

2.2轉染miR-581-mimic后各組細胞miR-581的表達 ESCC細胞K30轉染miR-581-mimic后，qPCR檢測結果顯示，與miR-581-NC組比較，miR-581的表達在miR-581-mimic組顯著上升(P<0.01)，提示miR-581轉染成功(圖2)。

miR-581-NC：陰性對照組；miR-581-mimic：轉染miR-581-mimic組. 與miR-581-NC組比較，△△：P<0.01.圖2 PCR檢測轉染miR-581-mimic后K30細胞miR-581的表達水平Fig 2 The expression levels of miR-581 in K30 cells after transfection with miR-581-mimic were detected by q-PCR

2.3過表達 miR-581對ESCC細胞增殖能力的影響 為檢測miR-581對ESCC細胞增殖能力的影響，將miR-581-mimic轉染K30細胞。CCK8細胞增殖實驗結果顯示，從第72小時開始，與miR-581-NC組比較，miR581-mimic組細胞的增殖能力明顯下調(P<0.05，圖3)。

miR-581-NC：陰性對照組；miR-581-mimic：轉染miR-581-mimic組. 與miR-581-NC組比較，△：P<0.05，△△：P<0.01.圖3 轉染miR-581-mimic后K30細胞的增殖情況Fig 3 The proliferation of K30 cells after transfection with miR-581-mimic

2.4過表達miR-581對ESCC細胞遷移及侵襲能力的影響 為檢測miR-581對ESCC細胞遷移及侵襲能力的影響，將miR-581-NC和miR-581-mimic分別轉染K30細胞。Transwell遷移及侵襲實驗結果顯示，與miR-581-NC組比較，轉染miR-581-mimic后，miR-581-mimic組穿膜的細胞數顯著減少，差別具有統計學意義(P<0.01，圖4)。

A：顯微鏡下圖片(結晶紫染色 ×100)；B：統計分析結果. miR-581-NC：陰性對照組；miR-581-mimic：轉染miR-581-mimic組. 與miR-581-NC組比較，△△：P<0.01.圖4 Transwell檢測轉染miR-581-mimic后K30細胞的遷移及侵襲情況Fig 4 The migration and invasion abilities of K30 cells transfected with miR-581-mimic were analyzed by Transwell assay

3 討 論

miR-581是新近發現的microRNA，在肝癌和結直腸癌中表達下調[9-10]。本研究結果顯示，miR-581在ESCC組織中表達顯著低于其相應的癌旁組織，與Zhang等的研究結果較為一致[9]。

研究報道，miR-581在腫瘤的進展中發揮著一定的作用[10-12]。過表達miR-581可抑制結直腸癌侵襲和轉移[10]。在非小細胞肺癌A549細胞中，過表達miR-581可抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。本研究通過轉染miR-581 mimic使K30細胞過表達miR-581，探討其對K30細胞生物學特性的影響，結果發現，上調miR-581的表達可抑制K30細胞的增殖能力、遷移及侵襲能力，說明在食管癌的發生發展過程中，miR-581可能發揮著抑癌基因的作用。

本研究初步證實了miR-581能夠抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，但尚未探索miR-581調控ESCC K30細胞的具體機制。文獻報道，miR-581能與PRDX1 3’UTR特異性結合，抑制PRDX1蛋白表達，從而抑制結直腸癌的增殖和侵襲[10]。在結直腸癌SW620細胞中過表達miR-581后，MMP-1和MMP-9表達水平下降，說明miR-581可能通過抑制MMP的表達而抑制腫瘤的侵襲和轉移[12]。Zhang等根據miRTarBase數據庫對miR-581的下游靶基因進行預測，發現MAP4K3，MAP4K4，SLC1A3及ZNF131等可能是其靶基因[9]。然而，miR-581抑制ESCC K30細胞的增殖、遷移和侵襲是否與這些基因有關，有待進一步的深入研究。