5 種中西藥復方對昆明小鼠的肝損傷作用

田陽陽，代敬文，姜 滔，賈文茜，帥 陳，劉珍妮，慈雷雷，呂雄文

（安徽醫科大學藥學院 安徽省天然藥物活性研究重點實驗室 重大自身免疫性疾病安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230032）

中藥是指在中醫理論指導下，用于預防、治療、診斷疾病并具有康復保健作用的物質［1］。我國的傳統中藥有丸、散、膏、丹等，解放以后又創制了不少新品種統稱之為中成藥以示與西成藥有所區別［2］。近代中醫張錫純應用西藥與中藥配伍，用石膏阿司匹林湯，治療溫病周身壯熱證［3］。到現代，目前已上市中西藥復方制劑共648 個品種［4］。中西藥復方制劑在中成藥中所占比例大約為百分之十左右［5］。中西藥復方制劑是“中藥、化學藥品及天然藥物組成的復方制劑”［6］。在我國當前的藥品注冊分類中“中藥、天然藥物和化學藥品組成的復方制劑”簡稱中西藥復方制劑［7-8］。中西藥復方制劑目的是提高療效，但由于缺乏基礎研究、臨床試驗，說明書不完善等使得臨床上多次出現使用這類制劑的不良反應［9］。近年來，在國家發布的76 期藥品不良反應信息通報當中，有四期與中西藥復方制劑有關，包括維C 銀翹片、感冒清片、珍菊降壓片、新復方大青葉片、腦絡通膠囊五種。藥源性疾病一般多發肝損傷，即藥物性肝損傷［10］。目前在美國、英國及歐洲，對乙酰氨基酚是導致急性肝功能衰竭的主要原因，在美國該比例為46%，在英國及歐洲該比例為40% -70%［11］。而維C 銀翹片、感冒清片、新復方大青葉片都含有對乙酰氨基酚成分，且通報當中出現不同程度的肝毒性。并且，有研究表明［12］A1R、A2AR 共同參與了對乙酰氨基酚誘導的肝損傷。本研究擬通過對KM 小鼠不同給藥周期，從而探討藥物對肝臟的毒性及其可能存在的機制。

1 材料

1.1 動物 KM 種小白鼠，清潔級，雄性，體質量18～22 g，購自濟南鵬悅實驗動物繁育有限公司（生產許可證號SCXK（魯）2014-0007）。自由進食及飲水，普通動物飼料喂養，模擬自然光照環境12 h 光照，12 h 黑夜中飼養1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 感冒清片（廣州白云山醫藥集團股份有限公司，批號4180038）；腦絡通膠囊（廣州白云山光華制藥股份有限公司，批號c70040）；維C 銀翹片（貴州百靈企業集團制藥股份有限公司，批號20180422）；新復方大青葉片［榮昌制藥（淄博）有限公司，批號180201078］；珍菊降壓片（陜西東泰制藥有限公司，批號71010720067）；腺苷A1R（S/N3329326）、A2AR（S/N3507839）抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；β-actin 一抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號AH01032107）；AST（批號20180307）、ALT（批號 20180306）、TBA（批號20180425）、AKP（批號20180416）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 中西藥復方藥物性肝損傷模型的建立 將180 只18～22 g 昆明小鼠隨機分為空白組、感冒清片組、腦絡通膠囊組、維C 銀翹片組、新復方大青葉片組以及珍菊降壓片組，每組30 只。給藥組每天按照體質量給人用劑量的9.1倍［13］的每日用藥量，維C 銀翹片460 mg/kg；感冒清片400 mg/kg；新復方大青葉片388 mg/kg；腦絡通膠囊460 mg/kg；珍菊降壓片114 mg/kg，空白組給予等量的生理鹽水，每組都為單次灌胃給藥。每兩天記錄1 次小鼠體質量，根據體質量計算給藥濃度。分別在給藥7、15、30 d后每組隨機取10 只鼠眼眶取血后剖腹取肝，稱定肝質量。留取血液樣本測定肝功能指標，肝組織部分-80 ℃保存，部分4%多聚甲醛固定。

2.2 小鼠體質量和肝指數 根據每次記錄的小鼠體質量，計算每組小鼠平均體質量，分別對比給藥7、15、30 d 后給藥組和空白組體質量變化。計算每組小鼠肝指數，分別對比給藥7、15、30 d 后給藥組和空白組肝指數變化。

2.3 肝功能生化指標的檢測 取血液于1.5 mL 離心管室溫放置4～6 h，能看到明顯的血清分離后；于4 ℃下，4 000 r/min離心10 min 得血清，利用相應試劑盒酶標儀法測小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總膽汁酸（TBA）水平。

2.4 肝臟組織病理學 采用HE 染色法。通用型4%多聚甲醛固定液固定24 h 后，不同梯度酒精進行組織脫水，二甲苯透明處理。石蠟包埋后進行切片處理，然后展平烤片。烤片后，兩次二甲苯脫蠟處理，再經脫水。在蘇木精水溶液中染色后，浸在1%鹽酸乙醇中片刻后，立即沖洗。酒精伊紅染色液染色2～3 min，再次用無水酒精進行脫水處理，再次二甲苯透明處理。中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

2.5 肝組織中A1R、A2AR 蛋白表達 采用Western blot法，肝組織破碎裂后離心，取上清液進行蛋白濃度定量，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴鍋內煮沸10 min。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80 V 恒壓30 min 濃縮，120 V恒壓50～60 min 分離）。電泳結束后用濕轉儀在冰水冷卻中將相應蛋白轉移到PVDF 膜上，膜在封閉3 h 后，TBST 清洗后，加入一抗中。放置過夜，加入二抗搖床孵育1 h，TBST 清洗，顯影。

免疫組化染色（Immunohistochemistry staining，ICH）法，4%多聚甲醛固定24 h 后的肝組織制成組織蠟塊后進行3～5 μm 厚度切片。經免疫組化染色染色后觀察其相應蛋白表達情況。

2.6 統計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行分析，用GraphPad Prism 軟件驗證繪圖。以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩個獨立樣本比較采用t檢驗，以P≤0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠體質量變化 新復方大青葉片組和珍菊降壓片組小鼠體質量增長較慢，且和空白組相比較，差異無統計學意義。維C 銀翹組、腦絡通膠囊組、感冒清片組小鼠體質量較空白組增長較快（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠給藥30 d 體質量變化曲線（n=10）

3.2 小鼠肝指數變化 給藥7、15 d 后，各給藥組小鼠肝指數和空白組相比，差異無統計學意義。給藥30 d 后，感冒清片組、腦絡通膠囊組、珍菊降壓片組肝指數較空白組，差異無統計學意義。維C 銀翹片組、新復方大青葉片組肝指數較空白組增加（P＜0.05），見圖2。說明給藥30 d 后維C 銀翹片組、新復方大青葉片組小鼠肝臟有明顯的增大。

圖2 給藥30 d 后各組大鼠肝指數（n=10）

3.3 肝功能生化指標 給藥7 d 后，各給藥組小鼠肝功能指標AST、ALT、AKP、TBA 和空白組相比，差異無統計學意義；給藥15 d 后，僅維C 銀翹片組、新復方大青葉片組、珍菊降壓片組小鼠肝功能指標TBA 水平較空白組增加，見圖3；給藥30 d 后，與空白組比較，C 銀翹片組、新復方大青葉片組肝功能指標AST、ALT、AKP、TBA 水平增加（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

3.4 肝組織HE 染色結果 給藥7、15 d 后，各給藥組小鼠肝組織HE 染色結果和空白組相比均未見明顯損傷；給藥30 d，空白組肝小葉結構正常，無腫脹、壞死，肝小葉及匯管區無炎細胞浸潤；與空白組相比維C 銀翹片組和新復方大青葉片組肝小葉肝索不規則排列，界限模糊且有炎性細胞浸潤，見圖5。提示小鼠肝臟有明顯損傷。

3.5 維C 銀翹片、新復方大青葉片對肝組織A1、A2A 受體表達影響 Western blot 結果顯示，維C 銀翹片組、新復方大青葉片組肝組織A1R、A2AR 蛋白表達隨著給藥時間的延長依次表達增高，見圖6～7；給藥30 d，與空白組比較，維C 銀翹片組、新復方大青葉片組A1R、A2AR 蛋白表達升高（P＜0.01），見圖8～9。免疫組化結果顯示，給藥30 d 后，維C 銀翹片組和新復方大青葉片組相比空白組，A1 受體表達增高（圖10、12），A2A 受體表達也略有增加（圖11、13）。提示其肝損傷可能與肝組織中A1、A2A 受體表達增高有關。

圖3 給藥15 后各組大鼠肝功能指標（n=10）

圖4 給藥30 d 后各組大鼠肝功能指標（n=10）

圖6 不同給藥時間維C 銀翹片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達的影響（n=3）

4 討論

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是最常見和最嚴重的藥物不良反應之一，藥物性肝損傷是指由各類處方或非處方的化學藥物、生物制劑、傳統中藥（TCM）、天然藥（NM）、保健品（HP）、膳食補充劑（DS）及其代謝產物乃至輔料等所誘發的肝損傷［14］。根據國家藥品監督管理局2018 年4 月10 日發布的國家藥品不良反應監測年度報告（2017）抗感染藥嚴重藥品不良反應/事件報告，口服制劑累及器官系統排名第1 位的是肝膽損害（26.1%）。其中也包括一些中西藥復方，中西藥復方制劑的組方復雜，臨床使用范圍較廣，存在用藥安全隱患［7］。本研究涉及到的中西藥復方制劑給藥30 d 后，給藥組小鼠體質量較空白組增加明顯，可能是由于其復方制劑含大量輔料所致，特別是維C 銀翹片，其為糖衣片。從血清指標和病理切片判斷，僅給藥30 d 后維C 銀翹片組和新復方大青葉片組對小鼠肝臟有明顯損傷，說明給藥7、15 d時對小鼠肝臟影響較小。其肝組織A1、A2A 受體的表達情況可以看出，給藥時間越長A1、A2A 受體表達越多，給藥30 d 后和空白組相比表達明顯增高，其肝損傷可能與A1、A2A 蛋白表達增高有關。如果抑制A1、A2A 受體表達是否會改善維C 銀翹片和新復方大青葉片導致的肝損傷還有待進一步研究。目前關于藥物性肝損傷的發病機制的研究已經有部分成果，大多是多種機制協同作用和（或）前后作用的結果導致［15］。A1、A2A 受體表達的增多可能意味著，其上游或者下游通路在維C 銀翹片和新復方大青葉片給藥30 d 后導致的肝損傷中發揮著重要作用。目前，對于藥物性肝損傷的治療主要是停用可能導致肝損傷的藥物，對癥治療，嚴重的話可能還需要肝移植［16］。從理論上講藥物對肝臟的損傷在客觀上是不可避免的［17］，除了在上市后嚴密監測藥物的不良反應以外，還可以把藥物警戒理念引入監測和評價過程中［18］。中西藥復方由于其成分比較復雜可能會在用藥的過程中導致重復用藥，中西藥聯用更易導致不良反應［19］。對于藥物性肝損傷預防是關鍵，要對藥物副作用和不良反應有充分的了解，盡量少使用肝損傷較大的藥物，避免過長期用同一種藥物，不要重復用藥。

圖7 不同給藥時間新復方大青葉片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達的影響（n=3）

圖8 給藥30 d 后維C 銀翹片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達的影響（n=3）

圖9 給藥30 d 后新復方大青葉片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達的影響（n=3）

圖10 給藥30 d 后維C 銀翹片組A1R 蛋白的表達情況（×200）

圖11 給藥30 d 后維C 銀翹片組A2AR 蛋白的表達情況（×200）

圖12 給藥30 d 后新復方大青葉片組A1R 蛋白的表達情況（×200）

圖13 給藥30 d 后新復方大青葉片組A2AR 蛋白的表達情況（×200）