對2015 年版《中國藥典》中茜草定量測定方法的改進

楊 麗

（白銀市藥品檢驗檢測中心，甘肅 白銀 730900）

茜草系茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根莖，隨著人們對中醫藥事業的關注度日益提高，其藥用價值也日益顯現［1-4］。2010、2015 年版《中國藥典》茜草中羥基茜草素、大葉茜草素的含有量測定方法采用一次過夜超聲、二次化學反應提取后HPLC 法定量分析。但前期發現，在供試品溶液制備過程中一次提取方法的選擇、濾液的收集裝置、二次化學反應的提取方法、裝置等問題值得商榷。本實驗參照文獻［5-7］，考察了供試品溶液制備過程中是否需要浸泡過夜、回流與水浴加熱凈化效果比較，以期為茜草質量控制提供參考依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 茜草來自甘肅省2019 年省評抽檢任務，經白銀市藥品檢驗檢測中心蘇學秀副主任中藥師鑒定為正品。大葉茜草素（批號110884-201606，純度99.5%）、羥基茜草素（批號111898-201603，純度98.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。磷酸、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

1.2 儀器 MSA 125P-1CE-DA 電子分析天平（德國賽多利斯公司）；EL204-IC 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置VWD 紫外檢測器（美國Agilent 公司）；恒溫水浴鍋。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），其他同2015 年版《中國藥典》（柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量20 μL），色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備 參照2015 年版《中國藥典》方法制備，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材（過2 號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min，放冷至室溫，甲醇補足減失的質量，濾過，精密吸取續濾液50 mL與具塞錐形瓶中，蒸干，精密加入甲醇-25% 鹽酸（4∶1）20 mL，70 ℃下回流提取30 min，取出，立即冷卻，精密加入3 mL 三乙胺，立即蓋上瓶塞，勻速振搖后靜置30 min，轉移至25 mL 量瓶中，甲醇少量多次洗滌容器內壁，洗液并入量瓶中，定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 重復性試驗 取同一批藥材6 份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定6 次，測得羥基茜草素、大葉茜草素含有量RSD 分別為1.5%、0.9%，表明該方法重復性良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取 “2.2”項下對照品溶液20 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得羥基茜草素峰面積RSD 為1.2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取2.4”項下供試品溶液1 份，室溫下于0、5、10、15、20、25 h 在“2.1”項色譜條件下各進樣20 μL，測得羥基茜草素、大葉茜草素峰面積RSD 均為0.9%，表明供試品溶液在25 h 內穩定性良好。

2.7 樣品含有量測定 取藥材粉末（過2 號篩），每批各2 份，分別按“2.3”項下方法和2015 版《中國藥典》方法制備供試品溶液，精密吸取對照品、供試品溶液各20 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量，結果見表1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3 討論

在一次提取階段，本實驗選擇甲醇、甲醇-25% 鹽酸（4∶1）作為溶劑［5-7］，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min、浸泡過夜后超聲（250 W、40 kHz）處理30 min、加熱回流30 min、浸泡過夜后加熱回流30 min作為提取方法，正交試驗進行篩選，最終確定最優方法為甲醇超聲（250 W、40 kHz）處理30 min。考慮到后續研究中蒸干容器對實驗的重要影響，又考察了具塞錐形瓶、燒杯、蒸發皿，發現具塞錐形瓶蒸干效果最好。二次提取容器與一次提取相同，能大大減少因殘渣溶解不完全或轉移過程中灑漏而導致的偶然誤差。

在二次反應階段，本實驗比較了水浴上直接敞口加熱水解、回流加熱水解，確定為70 ℃下加熱回流水解，可節省檢驗時間，避免溶劑揮發，減少檢驗難度，提高實驗效率。2015 年版《中國藥典》對加入三乙胺后的混勻時間未作出規定，而本實驗發現加入3 mL 三乙胺后混勻30 min即可反應完全，但此時由于發生化學反應，具塞錐形瓶中會產生大量白煙，故應及時蓋上瓶塞以確保反應完全發生。另外，反應液轉移至量瓶后加甲醇少量多次潤洗容器內壁，洗液并入量瓶中用甲醇定容時，成分含有量更高。

表1 各成分含有量測定結果（n=10）

綜上所述，2015 年版《中國藥典》茜草中羥基茜草素、大葉茜草素含有量測定方法值得商榷。近年來，學者對茜草主成分含有量［8-9］及其指紋圖譜［10-12］進行了研究，并標定了10～15 個色譜峰。本實驗通過與HPLC 色譜圖比對，發現隨著pH 變化大葉茜草素、羥基茜草素之間會相互轉化，故分別對兩者制訂標準并不能全面評價茜草質量。因此，建議在2015 年版《中國藥典》中茜草含有量測定方法的供試品溶液制備項下，應對一次提取方法、濾液收集裝置、二次化學反應條件、加三乙胺后混勻時間、反應液轉移至量瓶是否需要沖洗等內容進行修訂，并將羥基茜草素、大葉茜草素總含有量作為指標以使相關標準更準確、可靠、完善。